基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接的通關藤治療非小細胞肺癌的現(xiàn)代機制

康 樂，苗晉鑫，方曉艷，張 瑾，張亞楠，苗明三

（河南中醫(yī)藥大學 藥學院，鄭州 450046）

近年來，肺癌發(fā)病率和病死率不斷上升。其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌患者的4／5。臨床治療NSCLC以放化療為主，但該療法極易出現(xiàn)耐藥性和強副作用，且二線化療效果不佳；小分子酪氨酸激酶抑制劑和免疫療法的使用為一些患者中帶來前所未有的生存益處。但NSCLC的總體治愈率和生存率仍然很低［1］。中藥治療NSCLC有其獨特的療效，在提高NSCLC治愈率和改善NSCLC預后發(fā)揮了重要作用。

通關藤為蘿摩科植物通關藤（marsdenia tenacissima，MT）的干燥藤莖，具有止咳平喘，祛痰，通乳，清熱解毒的功效。通關藤又有烏骨藤、通光藤、奶漿藤等多個別名，是臨床常用抗癌藥物“消癌平”的主要成分，具有多糖、皂苷和生物堿等有效成分，其注射劑已在臨床用于肺癌（包括NSCLC）的治療或配合放療、化療的輔助治療［2］。MT治療NSCLC臨床療效確切，但其對NSCLC的基礎研究較少，抗NSCLC的藥用有效成分及分子作用機制尚未完全明確。

在藥物發(fā)現(xiàn)中的主要范例是設計最大選擇性配體以作用于單個藥物靶標的概念，但許多有效成分是通過調節(jié)多種蛋白質而不是單個靶標發(fā)揮的作用。基于網(wǎng)絡的方法有望突出對跨多個信息層面藥物作用的理解［3－4］。本研究采用網(wǎng)絡藥理學技術，探討MT防治NSCLC的物質基礎與作用機制，解決了篩選藥物效用基礎成本高及周期長的問題，可為相關新藥的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MT活性化合物的收集與篩選

通過國內外文獻查閱，搜集MT被報道出具有活性的化合物，通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫［5］獲得上述活性化合物的canoni-cal SMILES結構。

1.2 MT治療NSCLC作用靶點及主要化合物預測

將從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得的canonical SMILES結構式導入Swiss Target Prediction（http://www.swiss target prediction.ch/）數(shù)據(jù)庫［6］預測MT活性化合物靶點，默認選擇Homo sapiens，輸入化合物字符串SMILES，提交、預測、篩選與MT活性化合物相關的作用靶點。并通過UniProt（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，將檢索得到的所有靶點蛋白校正為標準名稱。

通過TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDDData bases/TTD/TTD.asp）數(shù)據(jù)庫、Drugbank（https://www.drugbank.ca）數(shù)據(jù)庫，鍵入“Nonsmall cell lung cancer”關鍵詞進行搜索NSCLC的相關基因，去除重復基因和假陽性基因。

將篩選得到的MT活性化合物靶點與NSCLC靶點輸入到Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）以獲取MT活性化合物靶點與NSCLC靶點的交集，即關鍵靶點。進一步利用Cytoscape 3.6.1軟件構建“MT-活性化合物-治療NSCLC靶點”網(wǎng)絡圖，并進行網(wǎng)絡拓撲分析，預測MT治療NSCLC的主要活性化合物。

1.3 PPI網(wǎng)絡模塊分析與篩選核心靶點

將獲得的關鍵靶點導入到STRING 11.5（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫，蛋白類型設置為“Homo sapiens”，獲取蛋白相互作用關系，并將蛋白相互作用信息導入到Cytoscape軟件中，繪制蛋白與蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡圖（protein-protein interaction，PPI）。節(jié)點大小以degree值反映，邊的粗細以combined score大小來反映。最后按degree值大小篩選核心靶點，通過ClusterONE插件進行模塊分析。

1.4 分子對接

篩選PPI中degree值排名靠前的核心靶點蛋白，從RCSB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得核心靶蛋白的蛋白配體復合物，利用PyMOL軟件將蛋白除水、除配體。采用SystemsDock Web Site（http://www.swissdock.ch/）將核心靶蛋白與MT活性化合物進行分子對接驗證，評價MT活性化合物與靶蛋白之間的結合活性，根據(jù)其結合能大小篩選出MT治療NSCLC的潛在核心化合物。

1.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析

將MT治療NSCLC的共有靶點導入ClueGO插件，預測MT治療NSCLC的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）的GO功能富集分析。并利用在線綜合性基因富集分析Enrichr（https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）數(shù)據(jù)庫［7］。利用P值大小為指標反映基因KEGG通路富集分析的情況。進一步將MT治療NSCLC的共有靶點輸入Reactome（http://www.reactome.org）數(shù)據(jù)平臺進行分析。Reactome數(shù)據(jù)平臺是一個開放的數(shù)據(jù)資源庫，收集了關于人類所有生物途徑與過程的結構化信息，通過疊加定量表達數(shù)據(jù)，能夠可視化了解受影響路徑的變化程度及進展［8］。通過Reactome分析獲得MT治療NSCLC作用靶點的結構化信息以及相關通路的分析報告。

2 結果

2.1 MT活性化合物

國內外文獻報道［9－15］顯示MT化學成分復雜。目前，從MT中分離得到的主要成分有甾體皂苷類、有機酸類、醇類、黃酮類和多糖等化合物。MT主要抗腫瘤的活性成分為甾體皂苷類物質。以報道具有活性的化合物為研究對象，共篩選得到17個活性化合物，將其依次輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，獲取相關化合物信息（見表1）。

表1 MT中活性化合物信息

2.2 MT治療NSCLC作用靶點及主要成分預測

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預測共獲得MT化合物靶點1 670個。從TTD數(shù)據(jù)庫獲取NSCLC疾病靶點40個，Drugbank數(shù)據(jù)庫134個，合并2個疾病數(shù)據(jù)庫檢索結果并刪去重復項，得到116個NSCLC相關基因靶點。利用Venny 2.1軟件，將MT活性成分靶點與NSCLC靶點繪制Venny圖，得到37個共有靶點，見圖1。并利用可視化軟件Cytoscape繪制MT治療NSCLC的“中藥－成分－靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2。

圖1 MT作用靶點和NSCLC靶點的Venny圖

圖2 “MT-活性成分-抗NSCLC靶點”網(wǎng)絡圖

圖2中綠色是MT抗NSCLC的活性成分，紫色靶點為藥物靶點與疾病靶點的共有靶點，即MT抗NSCLC的關鍵靶點。進一步根據(jù)網(wǎng)絡拓撲分析得到MT治療NSCLC主要作用的活性成分為通關藤皂苷H（Tenacissoside H）、通關藤皂苷G（Tenacissoside G）、羽扇豆醇（lupeol）、通關藤皂苷A（Tenacissoside A）、通關藤皂苷I（Tenacissoside I）、通關藤皂苷B（Tenacigenin B）等。

2.3 PPI網(wǎng)絡模塊分析與篩選核心靶點

將MT治療NSCLC的關鍵靶點，導入至STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白互作信息。使用Cytoscape 3.6.1軟件將靶點的度值（degree值）進行可視化展示，顯示各靶點具有很好的互作關系，見圖3（a）。圖中節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關聯(lián)，degree值越大，在網(wǎng)絡中與節(jié)點相連的數(shù)目越多，節(jié)點越大，越重要。其中，在網(wǎng)絡中degree值前10名的靶點為：血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、鼠雙微基因2（murine double minute2，MDM2）、Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）、細胞色素P4503A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR）、ATP結合盒轉運蛋白G2（ATP binding cassette transporter G2，ABCG2）。

圖3 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡（a）和模塊分析（b）示意圖

進一步將PPI網(wǎng)絡分為4個模塊，見圖3（b），以combine score進行聚類分析，選取各模塊的生物過程、分子功能以及KEGG通路。結果顯示：模塊1主要參與蛋白自身磷酸化、細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK1和ERK2級聯(lián)的正調控，影響ATP結合和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性，介導癌癥通路和癌癥MicroRNA信號通路而發(fā)揮作用。模塊2主要參與單萜類代謝過程和藥物分解代謝過程，影響類固醇羥化酶活性與ATP酶活性，通過ABC轉運體和藥物代謝－細胞色素P450信號通路發(fā)揮作用。模塊3主要通過神經(jīng)活性配體受體相互作用而發(fā)揮作用。模塊4主要參與氧化應激反應、環(huán)氧合酶途徑，影響血紅素結合和過氧化物酶活性，見表2。

表2 各模塊基本信息和主要生物過程、分子功能、KEGG通路分析結果

2.4 分子對接

選取PPI分析中degree值排名前4的蛋白，將其與MT活性化合物進行分子對接驗證。一般認為FullFitness分值越低，對接效果越好。分子對接結果顯示：VEGFA、EGFR和MTOR靶點對接得分最高的化合物均為通關藤皂苷（Tenacissoside H）；JUN對接得分最高的化合物為通關藤皂苷A（Tenacissoside A）。利用UCSF軟件將以上4對蛋白質與化合物的相互作用進行優(yōu)化（見圖4），對接效果最好的前4名活性化合物與VEGFA、EGFR、JUN和MTOR的FullFitness分值見表3。因此，通關藤皂苷H和通關藤皂苷A可能是MT抗NSCLC的重要活性化合物。

表3 前4名活性化合物FullFitness分值

圖4 與前4位核心蛋白對接評分最高的 活性化合物示意圖

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通過ClueGO對MT治療NSCLC的共有靶點進行GO富集分析，結果發(fā)現(xiàn)MT療NSCLC的生物功能主要定位在蛋白質自磷酸化、對軸突損傷的反應、細胞對外源性刺激的反應等；參與了膜筏、內膜系統(tǒng)細胞以及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性和血紅素結合等分子功能（見圖5）。

圖5 MT治療NSCLC的GO富集分析示意圖

通過Enrichr數(shù)據(jù)庫對MT治療NSCLC的共有靶點進行KEGG通路分析。按照P值（P＜0.05）進行篩選，結果顯示MT治療NSCLC主要涉及通路有癌癥、PI3K／Akt、粘附斑、癌癥MicroRNA、MAPK以及Rap1等信號通路。詳見圖6，圖中條帶長度表示P值大小，條帶越長，P值越小。

圖6 MT治療NSCLC的KEGG通路分析示意圖

進一步對MT治療NSCLC的共有靶點進行Reactome分析。圖7中每個圓形“爆發(fā)”的中心代表作用途徑，黃色表示靶點在該途徑的過度表示，淺灰色指沒有明顯代表性的路徑。結果顯示：MT治療NSCLC涉及多種生命活動事件，依次為信號轉導、免疫系統(tǒng)、基因表達、細胞周期、細胞對外界刺激反應、新陳代謝、細胞程序化死亡等。

圖7 MT治療NSCLC的共有靶點的全基因組示意圖

MT治療NSCLC的Reactome通路富集分析，根據(jù)P值（P＜0.01）得到512條通路，選取前20條信號通路（FDR值從小到大進行排序）繪制氣泡圖（圖8）。主要涉及白細胞介素4（Interleukin-4，IL-4）與白細胞介素13（Interleukin-13，IL-13）信號通路、受體酪氨酸激酶的信號轉導、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導、白細胞介素信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路，TFAP2（AP-2）家族調節(jié)生長因子及其受體的轉錄等通路。

圖8 MT治療NSCLC的Reactome通路富集分析氣泡圖

進一步以免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導為例分析（圖9），圖中黃色表示靶點在該途徑的過度表示，淺灰色指沒有明顯代表性的途徑，可以看出：MT治療NSCLC參與了促進細胞因子調節(jié)和介導免疫，其中，作用最明顯的為促進白介素與細胞表面受體結合和FMS樣的酪氨酸激酶3（fmslike tyrosine kinase，F(xiàn)LT3）配體（FL）的結合，并觸發(fā)下游各種路徑的激活，主要為JAK／STAT、PI3K／Akt和MAPK級聯(lián)反應等。

圖9 MT治療NSCLC在免疫系統(tǒng)中的 細胞因子信號傳導示意圖

3 討論

中醫(yī)對于NSCLC的病名并沒有明確的定義，多屬于中醫(yī)學“息賁”“肺積”“咳嗽”“喘息”“胸痛”“勞嗽”等病證的范疇，臨床上以咳嗽、痰中帶血、胸痛等為主要癥狀。從病因病機的角度，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為肺癌形成主要由于正氣虛損，邪毒內侵，損及肺脾，致使肺脾功能失調，肺失宣降，脾失健運，繼而釀生氣滯、痰飲、瘀血等病理因素，各種病理因素相互摻雜，導致肺癌的發(fā)生，其本質多為痰凝、瘀結或痰熱瘀互結［16］。通關藤具有具有止咳、平喘、化痰等功效，針對肺癌的病理因素可發(fā)揮較好的作用。目前，從MT中分離得到的主要成分有甾體皂苷類、有機酸類、醇類、黃酮類和多糖等。通過預測MT治療NSCLC的“中藥－成分－靶點”網(wǎng)絡結果顯示，MT治療NSCLC主要作用的成分為通關藤皂苷H（Tenacissoside H）、通關藤皂苷G（Tenacissoside G）、羽扇豆醇（lupeol）、通關藤皂苷A（Tenacissoside A）、通關藤皂苷I（Tenacissoside I）、通關藤皂苷B（Tenacigenin B）等。提示甾體皂苷類物質是通關藤藥材抗腫瘤的主要活性成分。已有研究表明通關藤皂苷H能夠顯著抑制LLC的生長和轉移，并能夠調節(jié)免疫細胞因子白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）的表達水平，從而提高荷瘤小鼠的免疫功能［17］。MT治療NSCLC的預測結果與目前相關研究結果基本一致，證明預測的可靠性，所以通關藤皂苷H、通關藤皂苷G、羽扇豆醇、通關藤皂苷A、通關藤皂苷I可能是MT治療NSCLC的主要活性成分，提示其具有重要的研究價值。

通過MT潛在靶點與NSCLC疾病靶點比對分析，得到MT治療NSCLC的作用靶點37個。進一步通過PPI網(wǎng)絡分析，度值較高的有VEGFA、EGFR、JUN、MTOR、PTGS2、MDM2、JAK2、CYP3A4、KDR、ABCG2，這10個靶點為MT治療NSCLC的關鍵靶點。VEGFA為血管內皮生長因子A，可以增加血管通透性，在腫瘤增殖、浸潤和轉移的過程中扮演重要角色［18］，血清VEGFA是預測NSCLC腫瘤內血管生成和預后的重要價值標記物［19－20］。表皮生長因子受體EGFR在NSCLC的發(fā)生、進展中同樣具有重要作用，并且有研究發(fā)現(xiàn)，p53能夠上調EGFR表達并激活EGFR通路［21］，TP53、EGFR共突變對NSCLC的治療有重要意義［22］。JUN編碼的蛋白質與病毒蛋白高度相似，與特定靶DNA序列直接相互作用從而調節(jié)基因表達。該基因是無內含子的，被定位到1P32-P31，一個涉及人類惡性腫瘤易位和缺失的染色體區(qū)域［23］。本研究分子對接結果顯示通關藤皂苷H與VEGFA、EGFR與MTOR均有很高對接得分、通關藤皂苷A與JUN產(chǎn)生較高的對接得分。提示了通關藤皂苷H和通關藤皂苷A可能是MT抗NSCLC的重要活性化合物。

NSCLC發(fā)病機制復雜，為了充分了解MT治療NSCLC的分子作用機制，本研究從多種途徑進行機制預測。我們對PPI網(wǎng)絡進行了模塊分析，結果顯示MT治療NSCLC主要通過癌癥通路、癌癥MicroRNA信號通路、ABC轉運蛋白和藥物代謝－細胞色素P450信號通路和神經(jīng)活性配體受體相互作用而發(fā)揮作用。通過ClueGO分析結果顯示，MT治療NSCLC的生物功能主要定位在蛋白質自磷酸化、對軸突損傷的反應、細胞對外源性刺激的反應等；參與了膜筏、內膜系統(tǒng)細胞以及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性和血紅素結合等分子功能，通過Enrichr數(shù)據(jù)庫KEGG結果顯示，MT治療NSCLC涉及癌癥、PI3K／Akt、粘附斑、癌癥MicroRNA、MAPK以及Rap1等信號通路。最后進行Reactome分析，結果顯示涉及多種生命活動事件包括信號轉導、免疫系統(tǒng)、基因表達、細胞周期、細胞對外界刺激反應、新陳代謝、細胞程序化死亡等。主要涉及IL-4與IL-13信號通路、受體酪氨酸激酶的信號轉導、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導、白細胞介素信號通路、VEGF信號通路，TFAP2（AP-2）家族調節(jié)生長因子及其受體的轉錄等通路。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，MT抗NSCLC可能的主要活性成分是通關藤皂苷H和通關藤皂苷A，與李媛媛等［24－25］研究結果一致。MT在改善NSCLC炎癥微環(huán)境，抑制NSCLC的腫瘤血管新生，誘導NSCLC的腫瘤細胞周期阻斷和細胞凋亡中發(fā)揮一定的作用，MT通過介導癌癥信號通路、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導、PI3K／Akt信號通路等多種疾病代謝信號通路發(fā)揮治療NSCLC的作用，尤其是免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導，包含了IL-4與IL-13信號通路、PI3K／Akt和MAPK等信號通路，可能在治療NSCLC中發(fā)揮更為關鍵的作用。體現(xiàn)了MT治療NSCLC多成分、多靶點、多通路、整合調節(jié)的復雜網(wǎng)絡機制。預測結果為下一步實驗研究奠定了基礎，下一步研究重點可圍繞通關藤對NSCLC模型IL-4／IL-13、PI3K／Akt和（或）MAPK信號通路的研究，以進一步驗證文中結果并闡釋通關藤治療NSCLC的分子機制。