絞股藍皂苷調控長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡對ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質沉積的影響及機制研究

宋 囡，曹慧敏，陳 絲，王 瑩，王 杰，王 群，賈連群*，楊關林*

1遼寧中醫藥大學 中醫藥創新工程技術中心 臟象理論及應用教育部重點實驗室；2遼寧中醫藥大學，沈陽 110847

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病前期的主要病理基礎,肝臟是AS及其相關疾病啟動和發展中最易受損的器官之一，其脂質沉積水平直接或間接反應動脈內膜脂質沉積情況，可作為預測AS水平的指標[1]。人類基因組中大部分為非編碼區，轉錄產生非編碼RNA(ncRNA)，微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(LncRNA)是ncRNA的兩個重要分類。其中，LncRNA通過多種機制在不同水平進行基因表達調控，發揮其生物學功能。近年來，miRNA和LncRNA在疾病發生發展中相互作用的分子機制引起了人們的注意[2]。長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1(taurine upregulates gene 1，TUG1)是一種進化上高度保守的長鏈非編碼RNA。有研究發現TUG1與食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌癥的發生發展有關[3]，但是其與肝臟脂質沉積及動脈粥樣硬化的關系，研究尚少。有研究發現干擾長鏈非編碼RNA TUG1可通過上調miR-26a緩解LPS誘導的線粒體損傷、細胞凋亡和炎癥反應[4]。

絞股藍(Gynostemmapentaphyllum，GP)是絞股藍屬(Gynostemma)的多年生草本藤本植物。其名最早見于明代的《救荒本草》。其具益氣健脾，化痰止咳，清熱解毒的功效。曾被科技部“星火計劃”列為待開發的“珍貴中草藥”，在2002年被衛生部列入保健品清單。自20世紀70年代以來，人們已經系統地研究了絞股藍的化學成分及藥理學作用。研究發現其主要藥用成分是絞股藍皂苷(gypenoside，GPs)。GPs通過降脂，抗血小板聚集和抗血栓形成發揮抗AS作用[5,6]。課題組前期采用ox-LDL誘導的血管內皮細胞出現線粒體膜電位損傷及呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性下降，并且明確了GP的有效成分GPs、絞股藍皂苷XILX、人參皂苷GRb3可以通過提高線粒體膜電位；影響線粒體能量代謝相關蛋白；上調ox-LDL誘導內皮細胞的自噬效應，降低內皮細胞損傷，發揮對ox-LDL誘導的內皮細胞的保護作用[7-9]。在前期研究的基礎上，本文重點關注GPs是否通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質沉積，進而防治AS。

1 材料

1.1 動物飼養及分組給藥

20只健康ApoE-/-小鼠，10只C57BL/6J小鼠，體重20±2 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，SPF級，環境溫度為22±1 ℃，濕度50%±5%，自然光照，正常飼料喂飼，自由飲食飲水，適應性喂養7 d后，將20只健康ApoE-/-小鼠隨機分為2組：模型組、絞股藍皂苷組，每組10只。給予高脂飼料喂飼，每日給予高脂飼料：脂肪供能比為41%的高脂純化飼料，通常稱為“西方飲食”飼料，額外添加0.15%膽固醇，喂飼12周。造模12周后，絞股藍皂苷組按照2.973 mg/kg/d灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃4周。

1.2 試劑、藥物與儀器

膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(四川邁新生物技術有限公司)；HE染色液(北京索萊寶科技有限公司)；一抗稀釋液(上海碧云天生物技術研究所)，Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP及GAPDH抗體(proteintech，中國)；絞股藍皂苷(西安天豐生物科技有限公司)；動物組織RNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；全自動生化分析儀(日本東芝)，7500Real Time PCR儀(美國Applied Biosystems)，Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統及配套試劑(ProteinSimple,San Jose，CA，USA)。

2 方法

2.1 動物處置

取材實驗前禁止進食12 h，不禁水，稱體重，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血約5～10 mL，靜置1～2 h，3 000 rpm離心30 min，分離血清，取上清液，低溫(4 ℃)保存。取小鼠肝組織并切成小塊，分別4%多聚甲醛固定及冷凍。

2.2 血脂檢測

按生化試劑盒說明書采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.3 HE染色觀察肝臟組織病理形態

將肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規方法進行。70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、切片(切片厚度5 μm)、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度酒精復水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色、伊紅復染后，再用70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片石蠟包埋，光學顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織形態。

2.4 實時熒光定量qPCR檢測長鏈非編碼TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表達

Trizol處理各組肝臟組織，提取總RNA，逆轉錄成cDNA，設定PCR反應條件，用SYBR Green Mater Mix試劑檢測待測基因的mRNA及miRNA水平(引物序列見表1)，共重復檢測3次。用ΔΔCT法對RT-PCR結果進行相對定量分析。ΔCT值為目的基因CT值與管家基因(GAPDH，U6)CT值的差值，ΔΔCT為各實驗組ΔCT與空白對照組ΔCT的差值。平均相對含量=2-ΔΔCT，為相對于正常組mRNA及miRNA水平。

表1 引物序列

2.5 Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統檢測Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP 蛋白表達

打開Wes、電腦和Compass軟件，進行硬件自檢。利用RIPA蛋白裂解液(含PMSF)提肝臟組織蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，使用Antibody Diluent II按1∶50比例稀釋一抗，每個樣品上樣量為4.5 μL(包括5×Master Mix 0.9 μL，樣品原液與0.1×Sample Buffer合為3.6 μL，95 ℃變性5 min)。樣品制備后，分別按照樣品、封閉液、一抗、二抗、發光液及清洗緩沖液的順序加入板內，排板布局，點擊start進行檢測，檢查結束后分析結果。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 絞股藍皂苷對ApoE-/-AS小鼠血脂水平的影響

與正常對照組相比，模型ApoE-/-小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，絞股藍皂苷組血清中TG、TC、LDL-C水平均發生顯著性降低(P<0.01)，HDL-C水平無明顯變化趨勢(見表2)。

表2 各組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的比較

3.2 絞股藍皂苷對ApoE-/- AS小鼠肝臟病理形態的改變

正常對照組肝小葉結構正常，肝細胞為圓形，細胞核居中，胞漿內未見脂滴，排列方式為條索狀且肝竇不狹窄；模型組肝細胞體積變大，胞漿內可見大量的脂肪空泡，且大小不等，肝竇狹窄或消失；絞股藍皂苷組較模型組有所變化，其肝細胞脂肪變性程度減輕，脂肪空泡明顯減少，肝竇狹窄有所減輕(見圖1)。

圖1 小鼠肝臟病理形態學改變結果(200×)Fig.1 Results of pathological morphological changes of mouse liver (200×) 注：A：正常組；B：模型組；C：絞股藍皂苷組Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group

3.3 絞股藍皂苷對ApoE-/-AS小鼠肝臟長鏈非編碼TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表達的影響

與正常組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Lnc-TUG1表達顯著升高，miRNA-26a顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，絞股藍皂苷肝臟Lnc-TUG1表達有所下降，miRNA-26a表達有所上調(P<0.05)；與正常對照組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved PARP mRNA表達顯著升高，cleaved caspase-9 mRNA僅有上升趨勢，Bcl2 mRNA顯著下降(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，絞股藍皂苷小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA表達顯著下調，cleaved PARP mRNA僅有下調趨勢，Bcl2 mRNA顯著上調(P<0.01或P<0.05,見圖2)。

圖2 各組小鼠肝臟Lnc TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA的表達(n=3)Fig.2 The expression of Lnc TUG1,miRNA-26a and Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP mRNA in the liver of each group of mice (n=3)注：A：正常組；B：模型組；C：絞股藍皂苷組。與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group.Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.The same below.

3.4 絞股藍皂苷對ApoE-/-AS小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白影響

與正常對照組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表達顯著升高，Bcl2蛋白顯著下降(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，絞股藍皂苷小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表達顯著下調，Bcl2蛋白顯著上調(P<0.01或P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白表達(n=3)Fig.3 The expression of Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 and cleaved PARP protein in the liver of each group of mice (n=3)

4 討論與結論

隨著人們生活水平顯著提高，飲食結構也有所改變，在高膽固醇飲食與高強度工作壓力等因素下，心血管疾病的發病率逐漸增高，AS為心血管疾病最主要的死亡因素，對其防治具有重要的意義。GP系葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本植物。絞股藍全草入藥，性涼，味苦、微甘，歸肺、脾、腎經，具有清熱解毒、止咳清肺祛痰、養心安神、補氣生精之功效[10]。GPs是從GP中提取的有效成分群，含有80余種人參皂苷類成分，所有GPs的苷元部分都為達瑪烷型四環三萜類，對治療和預防AS等心血管疾病有顯著功效[11,12]。

長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid，LncRNA)是一類長度超過200 nt的功能性RNA分子，不具有蛋白編碼功能，早期被認為是RNA轉錄過程中的“噪音”[13]。但近年來的研究發現，LncRNA參與人類多種疾病的發生、發展[14]。值得重視的是LncRNA也在心血管疾病中存在差異表達，并且通過不同的作用機制在心血管疾病的調控網絡中發揮作用，參與心血管疾病的發生發展。前期研究已明確miRNA通過與靶mRNA上的互補序列結合來抑制mRNA的翻譯或促進mRNA的降解[15]，而LncRNA可以作為miRNA海綿與miRNA相互作用[16]來影響mRNA進而調控基因表達。研究發現在缺氧/復氧條件下，LncRNA AK088388通過作為miR-30a的內源性RNA海綿來調節心肌細胞的自噬[17]。LncRNA Mexis是依賴于LXR轉錄的ATP結合盒轉運體A1(ABCA1)基因的擴增器，而ABCA1蛋白可將動脈血管壁細胞內的膽固醇泵出細胞，對高密度脂蛋白(HDL)的形成和膽固醇外流的調節至關重要[18]。可見，LncRNA參與脂質代謝影響AS發生發展機制研究不容忽視。TUG1是一種進化上高度保守的長鏈非編碼RNA，目前研究明確TUG1不僅與食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌癥的發生發展極為密切，LncRNA TUG1與miR-138-5p相互影響可能參與慢性心力衰竭的發病發展[19,20]，并且可通過上調miR-26a緩解LPS誘導的線粒體損傷、細胞凋亡。研究發現miRNA-26在心血管疾病中發揮重要作用，其在心臟疾病中表達下調，miRNA-26在心肌肥大中起關鍵作用，大鼠模型和心肌細胞中miRNA-26a/b表達均下調[21]。課題組前期研究發現，線粒體凋亡途徑在AS發生發展過程中發揮著重要的作用，并且在此過程中，GPs具有調節作用。根據ApoE-/-小鼠在高脂喂飼12周可出現典型的AS病理特征，本文選用AS經典模型(ApoE-/-的C57BL/6J小鼠)作為主要研究對象，以C57BL/6J小鼠作為正常對照[22]，重點關注GPs是否通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質沉積，進而防治AS。

研究發現GPs可以改善ApoE-/-AS小鼠血脂水平及肝臟脂質沉積情況，結果與前期研究一致。在此基礎上，首先發現ApoE-/-AS小鼠肝臟長鏈非編碼RNA TUG1明顯上調，而miR-26a顯著下調，經GPs干預后，上述情況出現反向結果。而線粒體凋亡途徑相關指標也同時發生變化，ApoE-/-AS小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達趨勢基本一致，在模型組中Bcl2 mRNA及蛋白表達顯著下調，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達出現上調，GPs干預后，Bcl2 mRNA及蛋白表達有所上調，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達有所下調。線粒體是細胞有氧呼吸的主要基地和供應能量的重要場所，在細胞凋亡的發生中發揮著重要的作用。線粒體是細胞凋亡的關鍵調節器，作為細胞的能量工廠，參與氧化磷酸化和ATP的生成，同時線粒體功能障礙也將會導致ATP合成受損。內源性線粒體途徑是細胞凋亡主要途徑之一，Cytc是線粒體內包含的與細胞凋亡存在密切關系的物質。在凋亡信號的刺激下，線粒體膜的通透性處于開發狀態，Cytc的釋放以及caspase的激活進而發生線粒體凋亡[23,24]。可見，Cytc由線粒體釋放至胞漿是引發線粒體凋亡途徑發生的關鍵步驟，Cytc釋放是在細胞凋亡早期發生的重要事件，具體環節為通過線粒體MPTP或Bcl-2家族成員調控的MOMP釋放到細胞質中，接下來釋放到細胞質中的Cytc進一步被利用，可在ATP/dATP存在的情況下，與caspase-9結合形成凋亡復合物，繼而活化caspase-9，活化后的caspase-9又可激活caspase-3，進一步啟動caspase級聯反應而導致細胞凋亡[25,26]。Caspase是一類酶原，正常狀態下是以無活性的結構存在的，caspase依賴的線粒體通路中，Cytc從線粒體釋放后與ATP，Apaf-1聯合構成多聚體，同時caspase-9和它結合構成凋亡體，可水解caspase-9酶原而激活caspase-9，激活的caspase-9又可以進一步激活caspase-3，活化的caspase-3可切割DNA修復酶PARP，使PARP被剪切為小片段，不能發揮其正常功能，進而導致DNA裂解，最終引起細胞凋亡[27,28]。綜上結果說明，GPs可能通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質沉積，進而防治AS，其干擾機制可能與調控線粒體凋亡的Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP表達水平有關。然而，其具體靶向調控關系，有待后續細胞實驗深入驗證，此研究有望為中藥防治疾病的網絡靶標分析、中藥多成分多靶點復雜機制解析等研究奠定基礎，為中西醫結合防治心血管疾病及臨床應用提供更有力的實驗依據。