Leukamenin E誘導人宮頸癌HeLa細胞胞質骨架重排和遷移抑制的研究

杜世龍，寧秀梅，何 苗，李翡翡，張 會，丁 蘭

西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070

真核細胞內的微絲、微管和中間纖維通過與其結合蛋白相互連接，形成了高度有序的三維網絡狀的胞質骨架系統，它們參與細胞內物質運輸、信息傳遞、細胞分裂、細胞遷移以及細胞形態維持等關鍵性細胞生命過程。細胞骨架的動力學過程受到高度調控以服務于細胞生命活動的需求，其組裝失調將導致細胞生長抑制，細胞分裂停滯，甚至細胞凋亡發生[1]。一些抗腫瘤藥物可通過改變細胞骨架的解聚和聚合作用，破壞微管的動態平衡，進而抑制細胞增殖，發揮抗腫瘤作用。植物源性抗癌藥物長春花生物堿和紫杉烷類藥物可與β-tubulin結合，干擾微管骨架的動力學過程，用于治療多種腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、急性白血病等[2]。以細胞骨架及其相關蛋白為靶點的抗腫瘤藥物的研究與發現已成為非常活躍的前沿研究領域[1]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為細胞內的信號分子，參與細胞增殖和分化等重大細胞生命過程[3]。在腫瘤細胞中由于代謝通路發生改變，ROS的含量增多，特別是H2O2顯著增加，使腫瘤細胞對ROS水平的變化更為敏感，因而ROS生成和抗氧化防御對細胞內組分的特定修飾被確定為癌癥治療的靶點[4]。研究顯示，由NADPH氧化酶和其他來源產生的ROS可直接修飾微絲、微管和中間絲蛋白而對其組裝-解組裝的動態過程產生影響[5]，或通過相關信號通路活化細胞骨架上游Rho GTP酶而重塑細胞骨架[6]。NADPH氧化酶介導的胞內氧化應激還對細胞骨架相關疾病有重要的調節作用[6]。近年來，研究者對ROS參與細胞骨架動力學調節產生了廣泛興趣。

香茶菜屬植物在我國分布90余種，供藥用的約有30余種，其中冬凌草(Isodonrubescens)曾被收入《中國藥典》，主要用于抗菌消炎及抗腫瘤等疾病的治療[7]。冬凌草素(oridonin)作為冬凌草的主要活性成分，其抗癌機制已有較深入研究，它的結構修飾物已作為抗白血病藥物進入一期臨床試驗[8]。現已發現對映-貝殼杉烷二萜約1 300余種，在香茶菜屬植物的枝葉中含量尤為豐富，該類化合物顯示了廣泛的抗癌活性，有望從中發現新的抗癌藥物[8]。目前僅有冬凌草素等極少數的對映-貝殼杉烷二萜的抗癌機制有較深入系統的研究，其他該類二萜的相關研究還很欠缺，但近年來也取得了一些重要進展。近年來，發現某些對映-貝殼杉烷二萜可作用于細胞骨架系統而發揮抗癌活性。例如，pharicin A直接靶向BubR1蛋白而激活紡錘體組裝檢查點，阻止細胞中期向后期轉換，抑制白血病細胞Raji和Jurkat的有絲分裂期[9]；wangzaozin A和epinodosin分別引起HeLa細胞和HL-60細胞骨架(微絲、微管和中間絲)重排[10,11]，與其誘導細胞分化相關聯；leukamenin E還能誘導HUVECs和PLC細胞的角蛋白磷酸化進而阻滯角蛋白纖維網絡正常組裝[12,13]。本文繼續報道leukamenin E對HeLa細胞的3種骨架纖維(微絲、微管及角蛋白纖維)重排的影響以及所導致的細胞生長和遷移抑制的可能機制，為闡明對映-貝殼杉烷二萜類化合物的抗癌分子機制提供線索，也為該化合物的進一步開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑與受試化合物

DMEM培養基、MTT、吉姆薩染色劑、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及TRITC Phalloidin(Sigma公司)；Pan-Keratin Mouse mAb、α-tubulin Mouse mAb(Cell Signaling Technology公司)；Goat anti-mouse IgG-FITC(Santa Cruz公司)；胰蛋白酶(trypsin,中國生工生物公司)；RNase A(Solarbio)；新生小牛血清(中國杭州四季青生物技術有限公司)；熒光探針DCFH-DA(2,7-dichlorfluorescein-diacetate)、抗氧化劑NAC(N-acetyl-L-cysteine)(江蘇碧云天生物技術研究所)，其他試劑均為國產分析純。

對映-貝殼杉烷型二萜leukamenin E由本實驗室從甘肅產總序香茶菜(Isodonracemosa(Hemsl) Hara)中分離得到，采用紫外，紅外，質譜，核磁共振等波譜學方法對其結構進行了鑒定[14]。用DMSO溶解leukamenin E(純度大于99.5%)，配制成10 mmol/L的母液于4 ℃儲存備用。本實驗體系中助溶劑DMSO終濃度小于0.01%，對細胞的生長無影響。Leukamenin E的分子結構如圖1。

圖1 Leukamenin E的化學結構Fig.1 Chemical structure of leukamenin E

1.1.2 實驗儀器

CO2培養箱(Forma Scientific，美國)，超凈工作臺(蘇凈集團，江蘇)，倒置顯微鏡(Olympus CKX41SF，日本)，正置熒光顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)，高速低溫離心機(Beckman Coulter Allegra64R，美國)，流式細胞儀(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

人宮頸癌細胞株HeLa購自中科院上海典藏細胞庫。細胞培養于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養基中，置于37 °C、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.2.2 MTT法檢測leukamenin E對HeLa細胞生長的影響

取對數生長期的HeLa細胞，以5 × 104個/mL的密度接種于96孔板，貼壁培養24 h后，加入含有不同濃度leukamenin E的培養基，繼續培養24或48 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后棄去培養基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，490 nm處測量OD值。

1.2.3 平板集落形成法檢測leukamenin E對HeLa細胞集落形成的影響

取對數生長期的HeLa細胞，以100個/孔的密度接種于24孔培養板中，24 h后加入與“1.2.2”相同的受試藥物濃度，培養7天后用甲醇固定，吉姆薩染色，在顯微鏡下記錄每孔的細胞集落數(≥ 50個細胞為一個集落)。

1.2.4 流式細胞術檢測leukamenin E對HeLa細胞周期的影響

細胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。當細胞培養48、72 h后收集細胞；預冷的PBS(pH7.4)洗2次，離心，棄上清。加入預冷的70%乙醇，4 ℃ 固定過夜，1 200 rpm離心5 min，棄固定液后用PBS洗2次，加入RNase A(終濃度100 μg/mL)，37 ℃ 孵育30 min后，再加入PI(終濃度40 μg/mL)避光孵育30 min后，260目尼龍網過濾，上機檢測。

1.2.5 吉姆薩染色觀察leukamenin E對HeLa細胞及細胞核形態的影響

細胞接種密度與藥物的處理見“1.2.2”。在細胞培養48 h和72 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照，且對細胞偽足進行定量分析[15]。在細胞培養48、72 h后，取出細胞爬片，PBS 洗2次，用甲醇-冰乙酸(3∶1)固定30 min，晾干后用吉姆薩染液染色20 min，用蒸餾水沖洗干凈，于顯微鏡下觀察細胞核形態并拍照。

1.2.6 劃痕法檢測leukamenin E對HeLa細胞遷移的影響

取對數生長期的HeLa細胞，以5 × 104個/mL密度接種于24孔板，待細胞培養24 h后，加入絲裂霉素(終濃度5 μg/mL)處理2 h，用滅菌的10 μL槍頭在每孔底部中間劃一窄線，用培養基洗去漂浮細胞，加入不同濃度的藥物。藥物處理24、48 h后置細胞培養板于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 TRITC Phalloidin檢測leukamenin E對HeLa細胞微絲的影響

細胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。待細胞培養48、72 h后取出細胞爬片，用PBS(pH7.4)洗3次/5 min，加入4%甲醛室溫下固定15 min，洗去固定液，PBS(pH7.4)洗3次/5 min；避光加入TRITC Phalloidin，置于濕盒內37 ℃ 孵育1 h后用PBS(pH7.4)洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光技術檢測leukamenin E對HeLa細胞微管的影響

細胞接種、藥物濃度、細胞爬片及固定與“1.2.2”所述相同。細胞固定后于室溫下透化15 min(PBS含0.3% Triton X-100)；吸去透化劑，加一抗置于37 ℃ 孵育1 h；PBS(pH7.4)洗3次后加二抗避光孵育2 h；用PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下用同樣的拍攝參數進行觀察、拍照。

1.2.9 間接免疫熒光技術檢測leukamenin E對HeLa細胞角蛋白纖維的影響

細胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。藥物處理48、72 h后，取出細胞爬片，PBS(pH8.0)洗3次/5 min；用預冷的甲醇在-20 ℃固定5 min后用PBS(pH8.0)洗3次/5 min；室溫下封閉1 h(封閉緩沖液：5%山羊血清，0.3% Triton X-100的PBS液)后，加一抗置于4 °C 冰箱孵育過夜；PBS(pH8.0)洗3次后加二抗避光孵育2 h，最后PBS(pH8.0)洗3次后封片，在熒光顯微鏡下用同樣的拍攝參數進行觀察、拍照。

按照上述相同的細胞接種濃度，用吉姆薩染色、劃痕法和免疫熒光技術分別測定了300 μmol/L NAC單獨或聯合1.0 μmol/L leukamenin E對HeLa細胞形態、細胞遷移以及3種細胞骨架纖維(微管、微絲和角蛋白纖維)重排的影響。

1.2.10 流式細胞術檢測leukamenin E對HeLa細胞聚合態纖維骨架含量的影響

細胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。待細胞培養48 h后，消化，用1 200 rpm離心5 min收集細胞，之后對細胞的處理方法同“1.2.7”“1.2.8”和“1.2.9”。PBS每次清洗后用1 200 rpm離心5 min收集細胞。260目尼龍網過濾，上機檢測。

1.2.11 流式細胞術檢測leukamenin E對HeLa細胞內ROS水平的影響

取對數生長期的HeLa細胞，以1 × 104個/mL密度接種于6孔板，不同藥物處理后離心收集各組細胞，PBS清洗后加入DCFH-DA熒光探針染色，收集細胞，PBS清洗去除未進入細胞內的DCFH-DA，上機檢測。

1.2.12 統計學分析

每組處理組隨機取50個細胞，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析平均熒光強度。細胞遷移距離采用Image J 1.52a軟件測量分析。柱形圖和折線圖使用Origin 2018軟件制作。實驗數據以mean±SD表示(n=3)，顯著性差異分析用SPSS 23.0軟件。P< 0.05為差異顯著，P< 0.01為差異極顯著。

2 實驗結果

2.1 Leukamenin E導致HeLa細胞的周期阻滯及細胞的增殖抑制

不同濃度的leukamenin E處理HeLa細胞24、48 h后，用MTT法檢測細胞活力(見圖2A)。如圖2A所示，與對照相比，0.4 μmol/L leukamenin E對HeLa細胞的增殖無明顯影響，而0.6～1.0 μmol/L leukamenin E顯示了顯著的抑制效應，其最高抑制率為20%(1.0 μmol/L， 48 h)。同樣，leukamenin E對HeLa細胞的集落形成能力也有顯著的抑制作用。如圖2B所示，對照組的細胞集落形成數目最多(63.2±3.3)，隨著藥物濃度的依次升高，HeLa細胞的集落形成能力明顯下降，各處理組與對照組相比均具有顯著差異。

進一步用流式細胞術檢測了0.4～1.0 μmol/L leukamenin E對HeLa細胞周期的影響。如圖2C所示，leukamenin E導致明顯的G1期阻滯。48 h對照組G1期細胞比率為46.9%，0.4、0.6、0.8和1.0 μmol/L處理組G1期細胞比率分別為51.7%、55.5%、57.5%和60.1%，分別增加了4.8%、8.6%、11%和13.3%；同時，各處理組的G2期細胞比率也有所增加，而S期細胞數出現下降，在1.0 μmol/L時下降了17.9%(見圖2C)。72 h處理組顯示了與48 h處理組相似的G1期阻滯效應：與對照組相比，72 h藥物處理組G1期細胞分別增加了4.9%、6.3%、10.3%和11.8%。同時S期細胞比率也出現下降，但G2期細胞變化不大(見圖2D)。

圖2 Leukamenin E對HeLa細胞增殖和細胞周期的影響Fig.2 Effects of leukamenin E on HeLa cells proliferation and cell cycle注：A：Leukamenin E對HeLa細胞的增殖抑制效應；B：Leukamenin E抑制HeLa細胞集落形成能力，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；C、D：48 h和72 h時leukamenin E對HeLa細胞周期的影響。Note:A:Leukamenin E inhibits proliferation of HeLa cells;B:Leukamenin E inhibits the colony forming ability of HeLa cells,compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01;C and D:Graph depicts the effects of leukameninE on HeLa cell cycle at 48 h and 72 h.

上述結果表明0.6～1.0 μmol/L leukamenin E通過對HeLa細胞的G1期阻滯而抑制其增殖。

2.2 Leukamenin E誘導HeLa細胞及細胞核形態的改變

不同濃度leukamenin E處理HeLa細胞48 h和72 h后的細胞形態如圖3A所示，對照組細胞形態呈不規則多邊形，處理組的細胞的整體形態呈現兩極伸長，向長條形變化的趨勢；細胞偽足呈現減少趨勢，較高濃度處理組(0.6～1.0 μmol/L)顯示了顯著或極顯著差異(見圖3C、D)。處理組中某些細胞兩端的偽足拉伸延長呈細絲狀，尤其在高濃度和長時間處理組中，這類細胞明顯增多，還觀察到長絲狀偽足交織成網狀的現象。

進一步通過吉姆薩染色觀察細胞核形態的變化。從圖3B可以看出，對照組的細胞核體積較大，呈圓形或卵圓形，有多個核仁，核漿比值大；當不同濃度藥物處理48 h后，核體積變小，核漿比值下降，核形態改變成為“腎形”的細胞比率增多，并發現在“腎形核”凹處其細胞質著色較淺，呈小空泡樣結構；當藥物處理72 h后，核體積和核漿比值進一步下降，但“腎形核”比率與48 h處理組相比卻有所減少，多數細胞核呈較小的橢圓形。核體積和核漿比值下降表明細胞代謝活動有所下降，而“腎形核”增多提示細胞骨架尤其是微管骨架可能有顯著重排。

圖3 Leukamenin E對HeLa細胞形態及核形態的影響Fig.3 Effects of leukamenin E on HeLa cells morphology and nuclear morphology注：A：48 h和72 h倒置顯微鏡下細胞形態的變化；B：48 h和72 h細胞核形態的變化；C、D：Leukamenin E處理48 h和72 h后HeLa細胞偽足數的定量分析，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖中箭頭指示細胞核為“腎形核”的細胞。Note:A:Changes of cell morphology under the inverted microscope at 48 h and 72 h;B:Changes in nuclear morphology at 48 h and 72 h;C and D:Quantitative analysis of the pseudopodia number of HeLa cells treated with leukamenin E at 48 h and 72 h,compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.The arrow in the figure indicates a cell with a "kidney-shaped nucleus".

2.3 Leukamenin E抑制HeLa細胞的遷移

劃痕實驗檢測leukamenin E對HeLa細胞遷移的變化結果如圖4所示。在24 h處理組中對照組細胞遷移明顯，其劃痕愈合率為51%±2.0%，而0.6、0.8和1.0 μmol/L藥物處理組的劃痕愈合率分別為43.5%±4.0%、31.4%±3.0%和23.7%±3.0%(圖4B)，表明leukamenin E對細胞的遷移有明顯的抑制效應；48 h后對照組大部分細胞已遷移靠近劃痕中線，其劃痕愈合率為62.7%±5.0%，而0.6、0.8和1.0 μmol/L處理組細胞的遷移受到明顯的抑制，其劃痕愈合率分別為51.0%±2.0%、36.9%±3.0%和29.4%±2.0%(見圖4C)。

圖4 Leukamenin E對HeLa細胞遷移的影響Fig.4 Effects of leukamenin E on HeLa cells migration注：A：不同濃度的leukamenin E對HeLa細胞遷移的抑制作用；B、C：不同濃度的leukamenin E處理24 h和48 h后HeLa細胞的劃痕閉合率，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:A:Inhibition of leukamenin E on HeLa cell migration at the indicated concentrations;B and C:Scratch closure rate of HeLa cells treated with the indicated concentrations of leukamenin E for 24 h and 48 h,compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.4 Leukamenin E誘導HeLa細胞的微絲、微管及角蛋白纖維的重排

分別用0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L的leukamenin E處理HeLa細胞48 h、72 h，通過TRITC Phalloidin染色微絲或者免疫熒光染色微管和角蛋白纖維后觀察其變化，結果如圖5所示。從圖5A可以看出，對照組細胞胞質中可見清晰的平行束狀應力纖維(微絲)，貫穿于整個細胞胞質，數量較多。0.4 μmol/L的leukamenin E對HeLa細胞中應力纖維的影響與對照組相比沒有顯著變化，而0.6～1.0 μmol/L的leukamenin E顯著減少胞質中的應力纖維數量，并顯示了濃度依賴性(見圖5A、B)。另外，表示胞質中微絲含量的細胞的平均熒光強度也隨leukamenin E的濃度增加而降低，較高濃度處理組細胞顯示了顯著性或極顯著差異(圖5D)，表明leukamenin E本文實驗條件下可減少微絲數量，主要減少應力纖維的數量。

利用間接免疫熒光技術對微管染色，結果如圖5A所示。對照組細胞中的微管網絡在胞質中呈致密的均勻分布；0.4 μmol/L處理組細胞的微管網絡與對照組細胞相比沒有發生明顯變化，而在0.6、0.8和1.0 μmol/L藥物處理組細胞中的微管分布有明顯改變：核周出呈現較強的熒光斑，表明微管在此有聚集，且隨著處理藥物濃度的升高和時間的延長，這種現象更為明顯。經Image Pro Plus 6.0軟件分析顯示，處理組細胞中微管的平均熒光強度與對照組細胞相比顯著增加(見圖5E)，表明leukamenin E可增加HeLa細胞微管數量，主要刺激核周區域微管的聚集。

圖5 Leukamenin E對HeLa細胞3種細胞質骨架分布的影響Fig.5 Effects of leukamenin E on the distribution of three cytoskeleton in HeLa cells注：A：48 h處理組細胞內微管、微絲和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；B：72 h處理組細胞內微管、微絲和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；C：具有長絲狀偽足細胞的微管和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；D～F：不同處理組細胞的微絲、微管和角蛋白纖維的平均熒光強度值，分別與48 h或72 h的對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。白色箭頭指細胞骨架的排列發生顯著改變的胞質區域，標尺10 μm。Note:A:Fluorescence microscope images of intracellular microtubules,microfilaments and keratin filaments in treated cells at 48 h;B:Fluorescence microscope images of intracellular microtubules,microfilaments and keratin filaments in treated cells at 72 h;C:Fluorescence microscope images of microtubules and keratin filaments in cells with cytoplasmic elongation.D-F:The average fluorescence intensity values of microfilaments,microtubules and keratin filaments of cells in different treatment groups,respectively compared with the control group of 48 h or 72 h,*P < 0.05,**P < 0.01;The white arrow points to the cytoplasmic area where the arrangement of the cytoskeleton has changed significantly,and the scale is 10 μm.

對角蛋白中間纖維進行免疫熒光染色，其觀察結果如圖5B所示。對照組細胞的角蛋白纖維呈致密的網狀結構，且均勻分布；0.4和0.6 μmol/L處理組細胞在48 h和72 h時其角蛋白纖維的分布與對照相比無明顯變化，但核周角蛋白纖維的熒光強度有增加趨勢，0.6 μmol/L處理組(48 h和72 h)角蛋白纖維的平均熒光強度均具有顯著性上升；0.8和1.0 μmol/L處理組細胞與對照相比其角蛋白纖維分布明顯改變，在核周有聚集的趨勢，尤其是48 h處理組細胞在核周出現較強的熒光區域，纖維變粗，而72 h處理組細胞核周熒光區與48 h處理組細胞比卻有顯著的減弱。

如前所述(見圖3A)，較高濃度藥物和較長時間處理組的細胞形成伸長的絲狀偽足，經免疫熒光染色后，發現這些偽足中含有豐富的微管和角蛋白纖維，清晰可見其平行束狀排列(見圖5C)。但在微絲的染色中未見這些長絲狀偽足中有應力纖維分布。從上述這些現象可知，藥物處理后微管和角蛋白纖維的重排明顯，最明顯特征是核周及偽足處聚合度明顯增加。

2.5 Leukamenin E引起HeLa細胞微絲、微管及角蛋白纖維的聚合度改變

細胞經免疫熒光染色后用流式細胞術測量胞內微絲、微管和角蛋白纖維的含量。由于樣品處理過程使細胞內可溶性蛋白流出(低聚合的骨架纖維也有流失)，因而，此方法所檢出數據表示聚合態纖維骨架含量。

用0.4和0.8 μmol/L的leukamenin E處理HeLa細胞48 h后用流式細胞儀檢測細胞中3種骨架纖維含量，評估其聚合特性，結果如圖6所示。從圖6可以看出，與對照組相比，高濃度處理組(0.8 μmol/L)細胞的聚合態微絲含量顯著減少，而聚合態微管的含量卻顯著增多，其中0.4 μmol/L和0.8 μmol/L處理組細胞中聚合態微管與對照組相比分別增加了204.1%和383.4%，并顯示了濃度依賴性，同時，處理組細胞中聚合態角蛋白纖維含量有較小幅增加，達到顯著性或極顯著差異(見圖6)。

圖6 Leukamenin E對HeLa細胞3種骨架聚合的影響Fig.6 Effects of leukamenin E on the aggregation of three cytoskeleton in HeLa cells注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.6 Leukamenin E引起HeLa細胞內ROS的變化

DCFH-DA(2′,7′-dichlorfluorescein-diacetate)可穿過細胞膜，在細胞內酯酶作用下水解生成無熒光的DCFH，細胞內的ROS可以進一步氧化DCFH生成具有熒光的DCF(2′,7′-dichlo-rofluorescin)，其熒光強度即可反映細胞內ROS水平。本實驗中，不同濃度的leukamenin E處理HeLa細胞6、12和24 h后，運用流式細胞儀檢測細胞內ROS的變化，其結果如圖7所示。從圖可以看出，0.6～1.0 μmol/L在相同濃度條件下，隨著處理時間的延長，ROS含量降低；相同處理時間條件下，隨著藥物濃度的升高ROS的含量明顯升高。與對照組相比，在0.6、0.8和1.0 μmol/L時顯示了顯著性差異，表明leukamenin E可在較短時間內較大幅度提高胞內ROS水平。

圖7 Leukamenin E對HeLa細胞內ROS的影響Fig.7 Effects of leukamenin E on ROS in HeLa cells注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.7 Leukamenin E聯合NAC對HeLa細胞形態、遷移以及3種細胞骨架形態的影響

為了求證leukamenin E誘導的ROS升高與HeLa細胞骨架重排、細胞形態以及細胞遷移的改變是否相關聯，將抗氧化劑NAC(可清除活性氧)和1.0μmol/L leukamenin E加入培養基中，共孵育HeLa細胞24、48和72 h后，檢測細胞形態、細胞遷移以及3種細胞骨架分布的變化，其結果如圖8所示。從圖8A可以看出，1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組細胞的形態與對照組細胞相比其伸長變形的細胞有明顯的增加(見圖8A：c和g)，細胞偽足數量比對照組有顯著減少(見圖8D)；300 μmol/L NAC對細胞形態沒有明顯的影響(見圖8A：b和f)，而NAC聯合leukamenin E處理組(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)的細胞形態與對照組細胞相比也未見明顯改變(見圖8A：d和h)，表明leukamenin E誘導細胞內ROS的產生與細胞形態的伸長改變相關聯。

圖8 NAC聯合leukamenin E使用對HeLa細胞形態、細胞遷移以及3種胞質骨架重排的影響Fig.8 Effects of NAC combined with leukamenin E on cell morphology,cell migration and three cytoskeletal rearrangement in HeLa cells注：A：NAC減弱了leukamenin E誘導HeLa細胞形態的改變；B：NAC減弱了leukamenin E誘導的細胞遷移的抑制效應；C：NAC減弱了leukamenin E誘導3種胞質骨架的重排，標尺10 μm；D～F：Leukamenin E聯合NAC使用對HeLa細胞形態、細胞遷移和胞質骨架重排的定量分析，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Le:Leukamenin E。Note:A:NAC reduced leukamenin E-induced changes of cell morphology;B:NAC reduced leukamenin E-induced inhibition of cell migration;C:NAC reduced leukamenin E-induced changes of the three cytoskeletal distribution in HeLa cells,scale 10 μm;D-F:Quantitative analysis of cell morphology,cell migration and cytoskeletal rearrangement in HeLa cells treated by leukamenin E combined with NAC.Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Le:Leukamenin E.

同樣，1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組對HeLa細胞3種細胞骨架的分布與對照組相比有明顯改變，具體細節與前面2.4中所述結果一致：胞質應力纖維顯著減少(見圖8C：c)；微管向核周聚集，而其他胞質區域的微管分布減少(見圖8C：g)；角蛋白也呈現不均勻分布也在核周聚集，纖維變粗(見圖8C k)。而NAC與leukamenin E聯合處理(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)顯著抑制了leukamenin E對HeLa細胞3種骨架形態的改變：與1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組誘導的改變相比，聯合處理組細胞的應力纖維在中央區域有所減少，但細胞周邊的應力纖維清晰可見(見圖8C：d)；微管和角蛋白纖維分布較為均勻，核周熒光強度相對較低，未見明顯的核周聚集現象(見圖8C：h和l)。進一步的熒光強度分析顯示，NAC在培養中的加入的確減弱了leukamenin E誘導的微絲、微管和角蛋白纖維的改變，表明leukamenin E誘導細胞內ROS的產生與HeLa細胞3種骨架的改變(重排)特征相關聯。

隨后，劃痕實驗檢測了NAC聯合leukamenin E使用時HeLa細胞的遷移變化，發現300 μmol/L NAC單獨處理HeLa細胞24 h后對細胞遷移顯示了一定的促進效應，但在48 h后其細胞遷移促進效應減弱，未顯示顯著性差異(見圖8B：b、f、j)，而NAC聯合leukamenin E使用后(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)顯著減弱了1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理對HeLa細胞的遷移抑制效應(見圖8B：d、h、l)，表明leukamenin E誘導細胞內ROS的產生與細胞遷移抑制效應相關。

3 討論與結論

近年來，對映-貝殼杉烷二萜的抗癌藥理活性引起了研究者的廣泛興趣，不同分子構型的該類化合物的抗癌機制的研究報道逐年增多[9,10,12,13,16]，發現該類化合物對細胞生命過程的影響是多方面的，在分子水平也顯示了多靶點效應。例如，通過多種細胞信號途徑誘導細胞凋亡和細胞分化[10,16-19]；靶向作用于過氧化物還原酶Ⅰ和Ⅱ、BubR1蛋白以及癌蛋白AML1-ETO[9,16]，并可調節NADPH氧化酶活性和誘導角蛋白磷酸化[10,12,13,17]。我們課題組相繼報道了對映-貝殼杉烷二萜對細胞骨架系統的影響：leukamenin E可誘導細胞角蛋白K8和K18磷酸化而抑制角蛋白的組裝[13]；epinodosin和wangzaozin A可分別影響HL-60和HeLa細胞骨架動態組裝，引起胞質骨架重排，改變微絲、微管和中間纖維骨架纖維的分布，干擾胞質骨架系統的穩態[10,11]，但其作用機制不甚清楚。

本文中我們首先研究了低濃度leukamenin E(0.4～1.0 μmol/L)誘導HeLa細胞骨架重排的特征。低濃度leukamenin E在較長時間(48 h和72 h)處理細胞后使細胞形態顯著變化，細胞形成長條狀，偽足數量顯著減少，偽足拉長，同時，核形態也發生明顯變化，“腎形核”數量增多。眾所周知，微絲、微管和中等纖維3種細胞骨架均具有維持細胞及其核形態的功能，因此這些變化提示leukamenin E可能干擾細胞骨架的動態平衡，誘導了細胞骨架的重排。進一步的熒光染色檢測證實了這一推測：胞質應力纖維數量減少，微管以及角蛋白纖維在核周聚集，微管和角蛋白中間纖維的排布明顯改變，某些微管和角蛋白中間纖維增粗(見圖5)。流式細胞術檢測也證實了HeLa細胞內聚合態微絲減少，聚合態的微管增加顯著以及角蛋白纖維聚合小幅上升(見圖6)。該結果與我們之前報道的對映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A對HeLa細胞骨架重排的誘導作用相類似[11]。但leukamenin E在高濃度(2.0～4.0 μmol/L)條件下處理HepG2、H1299、PLC和HUVEC細胞24 h，其細胞形態變化較小，與低濃度處理后的變化模式完全不同[12,13]。我們發現高濃度leukamenin E可激活細胞ERK信號通路，誘導K8-S431/73和K18-S52磷酸化，抑制角蛋白纖維組裝，減少角蛋白纖維數量[13]。這表明不同濃度的leukamenin E可參與調節細胞不同的信號通路，引起不同的細胞響應事件。

細胞骨架深度參與了細胞分裂和遷移的細胞功能，與細胞癌變及惡化密切相關。細胞骨架極其調節蛋白所組成的動態纖維網絡參與了細胞遷移的過程，表現為連續的細胞形態改變，細胞骨架重組并驅動細胞定向運動[20]。以細胞骨架為靶點的化合物(細胞松弛素類、秋水仙素和長春新堿等)通過影響細胞骨架組裝阻止細胞增殖和遷移。我們的研究表明，0.8～1.0 μmol/L leukamenin E可通過干擾HeLa細胞骨架的動態平衡，引起胞質骨架顯著重排，抑制細胞遷移，并通過阻滯細胞周期運轉降低細胞增殖速率，說明leukamenin E對于抗癌新藥的研究和發現具有重要價值。