含氨基酸的LCST型離子液體-水混合體系的相行為研究

李 艷，張莉莉，聶芳紅，高 靜,2*

1廣東海洋大學食品科技學院，湛江 524088；2廣東藥科大學食品科學學院，中山 528458

液-液萃取是一種利用溶質在液體各相中的溶解度差異而分離的常用技術，已廣泛用于提取有機化合物、藥物成分、氨基酸等物質[1-3]。然而，傳統萃取體系往往含有乙二醇、n-甲基吡咯烷酮、n-甲酰嗎啉等易燃、易揮發、有毒和回收能耗高的有機試劑[1]。因此，構建環境友好的液-液萃取體系替代有機溶劑已成為萃取研究領域的發展趨勢。

離子液體(ionic liquid，IL)是一種由有機陽離子和有機或無機陰離子組成的低溫液態鹽[4]。近年來，離子液體因其高溶解能力、高熱穩定和化學穩定、低蒸氣壓和結構可調性在天然產物提取中顯示出廣泛的應用前景。Lee等[5]向40 mL丙酮中加入10 mg 1-乙基-3-甲基咪唑溴作提取助劑，使三疣梭子蟹蝦青素的提取量增加了近9倍。離子液體作為有機溶劑的助劑能顯著提高生物分子的萃取率，但這些研究仍具有局限并依賴于大量使用有機溶劑。另一方面，離子液體自身黏度大，單獨使用不利于傳質，極大地限制了其在萃取領域中的應用。研究表明，向離子液體中添加少量水分，可有效降低離子液體的黏度，并且發揮離子液體的理化性能[6]。更重要的是，向離子液體中加入一定量的水，可以有效減少離子液體用量，降低成本。

盡管如此，萃取研究中經常使用的離子液體親水性較強，往往與水形成均相體系，在選擇性提取生物分子仍具有局限性。2017年，Shi等[7]用1-乙基-3-甲基咪唑溴/甲醇-正己烷制備的兩相體系，實現了磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的有效分離。離子液體-水混合體系在特定條件下產生液-液相分離，不僅能顯著提高對生物分子的選擇性萃取，且利于保持生物分子的活性[8]。因此，以疏水性較強的離子液體和水為主要成分構建新的液-液相平衡體系，對選擇性提取生物分子具有重要的指導意義。研究表明，能夠使離子液體-水混合體系成相的離子液體種類有1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸鹽、四丁基膦三氟乙酸鹽、四丁基磷翁乙酸鹽等[9,10]。這些離子液體多數帶有四氟硼酸根離子[BF4]-、六氟膦酸根離子[PF6]-、雙三氟甲基磺酰亞胺離子[Tf2N]-、三氟乙酸鹽離子[CF3COO]-等疏水性強的陰離子。

從食品、化工再到醫藥領域，含離子液體的溶劑體系適于萃取的目標物質種類越來越多，涉及的研究領域也越來越廣泛，其中溫敏型液-液萃取體系備受關注。研究報道，部分離子液體-水混合體系呈現出溫敏特性，相轉變表現為具有高臨界共熔溫度(UCST)和低臨界共熔溫度(LCST)兩類[9]。Wang等[11]研究表明1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-水二元液-液萃取體系，能選擇性分離菊花中的親脂和親水性物質。但是，以往的報道忽略了萃取目標產物作為離子液體體系參與者對相平衡的影響。

本文以氨基酸為生物分子模型，系統考察了甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸對[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水混合體系相轉變溫度的影響，研究了氨基酸在兩相中的分配特性隨溫度的變化規律，旨在為含離子液體的液-液體系的設計提供基礎數據，也為離子液體在天然產物的提取和分離方面的應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

四丁基膦三氟乙酸鹽([P4444]CF3COO)、三丁基辛基溴化膦([P4448]Br)，蘭州中科科特工貿有限公司；甲醇(色譜級)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)，阿拉丁試劑有限公司；所用試劑純度均> 99%；離子液體和氨基酸結構如圖1所示。

圖1 離子液體和氨基酸的化學結構及摩爾質量Fig.1 Chemical structure and molar mass of ILs and amino acids studied

1.2 儀器與設備

LD-20AD凝膠滲透液相色譜儀(日本島津公司)；DNP-9025電熱恒溫培養箱(上海鴻都電子科技有限公司)；KQ-300 超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；AW120電子天平(日本島津公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 溫度-組分相圖的測定

在分液漏斗中以1∶1質量比制備了一系列[P4444]CF3COO或[P4448]Br和水混合溶液，其中氨基酸的添加量是離子液體質量的0%～10%，在設定溫度下于恒溫培養箱中放置12 h后將上、下相完全分離后精密稱取其質量，測定并計算兩相中各組分(離子液體、水、氨基酸)的含量，根據相平衡后上、下相中離子液體的濃度以及相平衡溫度繪制溫度-組分相圖[12,13]。

1.3.2 組分測定

含氨基酸的離子液體-水混合體系在一定溫度下靜止12 h后會形成離子液體富集相和水富集相。其中各相中水分含量的測定方法參考國家標準G 5009.3-2016。[P4444]CF3COO或[P4448]Br含量采用高效液相色譜法測定，儀器參數：色譜柱：C18、柱溫：25 ℃、流動相：5%甲醇和95% 25 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)、流速：0.8 mL/min、檢測波長：198 nm、進樣量：20 μL、檢測器：UV檢測器。[P4444]CF3COO和[P4448]Br標準曲線見圖2。氨基酸含量根據物料衡算得出。氨基酸在離子液體-水混合體系中的分配系數KAA按公式(1)計算：

(1)

其中[AA]H2O和[AA]IL分別為氨基酸在水富集相和離子液體富集相中的含量。

圖2 離子液體的標準曲線Fig.2 The standard curves for ILs

1.3.3 上、下相密度測定

向質量比為1∶1的[P4444]CF3COO或[P4448]Br和水混合溶液中添加離子液體質量2%～10%的脯氨酸，在設定溫度下于恒溫培養箱中放置12 h。分別取上、下相溶液于10 mL容量瓶中，定容，在特定溫度的恒溫水浴鍋中放置0.5 h后稱重，各相體積對應質量的比值即為各相密度，平行測定3次并計算其相對平均偏差[14]。

1.3.4 數據處理方法

所有試驗平行測定3次，計算平均值和相對平均偏差。化學結構式采用Chemdraw 16.0作圖，Origin 8.0軟件用于回歸擬合試驗數據。

2 結果與分析

2.1 氨基酸對離子液體-水混合體系相行為的影響

2.1.1 添加氨基酸前后相轉變溫度的變化

首先繪制[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水混合體系的溫度-組分相圖，如圖3所示。[P4444]CF3COO和[P4448]Br的水溶液均表現為LCST型相行為特征，即升高溫度利于混合體系由均相轉變為兩相。與[P4444]+比較，[P4448]+具有更長的碳鏈，且摩爾體積更大，表現出更強的疏水特性。研究表明，同時含較多疏水陽離子和較少疏水陰離子的離子液體與水混溶后，表現出更強的LCST型相行為特征[10]。與CF3COO-比較，Br-的氫鍵相互作用能小，從水中接收質子的能力強，具有更強的親水性[15]。所以，[P4448]Br-H2O混合體系的相轉變溫度比[P4444]CF3COO-H2O的低，其成相能更強。

向[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水加入5%的脯氨酸，重新測定相圖。從圖3中可以看出，5%脯氨酸的加入使兩個體系的相變溫度均有所下降，表現為相圖中兩相區域面積增加。例如，當[P4444]CF3COOwt%=15%時，加入5%脯氨酸使[P4444]CF3COO-水體系相變溫度由38 ℃下降至35 ℃。根據“鹽析效應”，水分子與氨基酸中的氨基和羧基形成配合物引起溶液中離子液體疏水性增強和水分子空腔表面張力增大，從而促進兩相分離[16]。由此可見，氨基酸作為萃取目標分子，對液-液相平衡的影響不容忽略，應當引起萃取工藝設計的重視。

圖3 添加5%脯氨酸前后的離子液體-水混合體系的溫度-組分相圖Fig.3 Temperature-composition phase diagrams of IL-water mixtures before and after adding 5% proline注：IΦ、IIΦ分別代表“單相區”和“多相區”。Note:IΦ and IIΦ represent “one phase” and “two phase”.

2.1.2 氨基酸種類的影響

研究發現，只有疏水性強的離子液體和親水性好的氨基酸組合才能形成雙水相，例如四丁基溴化膦和脯氨酸[17]。本研究中，向[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水萃取體系逐次加入了親水性較強的甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和精氨酸，在一定溫度范圍內繪制溫度-組分相圖。如圖4所示，5種氨基酸均可顯著降低[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水體系的相轉變溫度，即添加親水性氨基酸利于LCST型離子液體-水體系形成兩相，促進能力依次是：甘氨酸 > 丙氨酸 > 賴氨酸 > 脯氨酸 > 精氨酸。這與氨基酸對離子液體-鹽雙水相體系的影響規律十分相近，如氨基酸對1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽/檸檬酸鈉雙水相的成相促進趨勢為：甘氨酸>丙氨酸≈賴氨酸>脯氨酸≈精氨酸[18]。氨基酸側鏈越短，親水性越強，越有利于離子液體從水中“析出”[16]。

圖4 含5%氨基酸的離子液體-水混合體系的溫度-組分相圖Fig.4 Temperature-composition phase diagrams of IL-water mixtures containing 5% amino acids注：A.[P4444]CF3COO-水；B.[P4448]Br-水。Note:A.[P4444]CF3COO-water;B.[P4448]Br-water.

另外，與堿性氨基酸比較，中性氨基酸對相變溫度的影響更顯著。例如，離子液體質量分數均為11%時，加入5%甘氨酸使[P4444]CF3COO-水體系相變溫度降低了近22 ℃，而加入5%精氨酸僅降低了4 ℃。Chen等[19]指出堿性氨基酸帶正電，側鏈帶有可質子化的堿性基團，且精氨酸堿性最強。Capela等[17]研究發現增大pH使色氨酸在離子液體相的分配含量增加。因此，帶電的氨基酸與離子液體建立了靜電相互作用，且帶電荷越多，靜電相互作用越強，對相變溫度的影響越小。

2.1.3 氨基酸濃度的影響

在一定溫度范圍內測定了含0%～10%脯氨酸萃取體系的溫度-組分相圖。根據圖5可知，增加脯氨酸的濃度使萃取體系的相變溫度大大降低，顯著提高了離子液體-水混合體系的成相能力。例如，固定離子液體質量分數為11%，改變萃取體系中脯氨酸濃度，[P4444]CF3COO-水相變溫度降低了近20 ℃，而[P4448]Br-水相變溫度降低了約6 ℃。根據前面所述可知，增加氨基酸濃度使“鹽析作用”加強，促使離子液體與水分離，迅速分成兩相。

圖5 含不同濃度脯氨酸的離子液體-水混合體系的溫度-組分相圖Fig.5 Temperature-composition phase diagrams of IL-water mixtures with different concentrations of proline注：A.[P4444]CF3COO-水；B.[P4448]Br-水。Note:A.[P4444]CF3COO-water;B.[P4448]Br-water.

為了進一步探究加入不同濃度脯氨酸后[P4444]CF3COO-水混合體系的相變規律，向體系中加入0.001 g/mL油紅，于25 ℃下混勻靜置12 h后對其相變現象進行了觀察(見圖6)。結果表明，油紅主要富集在離子液體相，隨著脯氨酸濃度的增加離子液體富集相由下相逐漸轉移至上相，且與氨基酸的遷移方向相反。脯氨酸濃度為6.54%時，體系上、下相密度接近相等，離子液體相開始由下相轉移至上相(見圖6c)，此時進一步增加脯氨酸可促進[P4444]CF3COO-水混合體系中離子液體向上相的遷移。前期關于離子液體-水混合體系的研究中并未發現相轉變的現象[10]。為更深入了解離子液體-水混合體系相轉變的原因，于25 ℃下測定了含不同濃度脯氨酸的[P4444]CF3COO-H2O混合體系各相的密度。由表1可以看出，當脯氨酸的質量分數大于5.66%，水相的密度逐漸增大并超過離子液體相，因而導致了離子液體-水混合體系上下相的交換。由此可見，選擇合適的離子液體-水配制比例對提高生物分子的萃取率顯得尤為重要。

圖6 25 ℃下含不同濃度脯氨酸的[P4444]CF3COO-H2O混合體系的相變現象Fig.6 Phase transition of the [P4444]CF3COO-H2O mixture with different concentrations of proline at 25 ℃注：油紅添加量為0.001 g/mL，集中在離子液體相；a～f分別對應表1中的a～f中混合體系的組成。Note:the added amount of oil red was 0.001 g/mL,which concentrated in ionic liquid phase;a-f corresponds to the composition of the mixtures in a-f in Table 1.

表1 25 ℃下含不同濃度脯氨酸的[P4444]CF3COO-水混合體系的各相密度

2.1.4 溫度的影響

研究指出，四丁基膦對甲苯磺酸鹽-水([P4444][TsO]-水)體系相變溫度約為53 ℃，四丁基膦-5-苯基四唑-水([P4444][Ph-tet]-水)約為37 ℃，四丁基膦水楊酸-水([P4444][Sal]-水)約為26 ℃[10,20]。相對而言，[P4444]CF3COO-水(30 ℃)和[P4448]Br-水(4 ℃)混合體系具有較低相轉變溫度(見圖3)。為研究溫度對LCST型離子液體-水混合體系相轉變的影響，觀察了不同溫度下含5%氨基酸的離子液體-水混合體系的相行為。從圖7可以看出，溫度升至40 ℃后，所有含氨基酸的離子液體-水萃取體系的上、下相均發生了置換。該體系的各相密度隨溫度變化的結果與宏觀現象一致，即升溫使[P4444]CF3COO-水體系的水相密度逐漸增大，而離子液體相密度逐漸減小。當溫度達到30 ℃后，水相密度大于離子液體相(表2)，因此宏觀上表現為離子液體相由下相轉移至上相。[P4448]Br-水體系也呈現出類似的變化規律。由此可知，向離子液體-水混合體系加入氨基酸后引起各相溶液密度變化，從而導致上、下相物質交換。需要補充說明的是，50 ℃下[P4444]CF3COO-水-脯氨酸體系在靜置12 h后并未呈現出理想的相分離狀態，而是表現為上、下相交換的過渡狀態。以上這些現象都證明，這種由溫度引起的各相物質遷移對萃取體系的工藝設計具有十分重要的參考價值。

圖7 不同溫度下離子液體-水-脯氨酸混合體系的相變現象Fig.7 Phase transition of IL-water-proline mixtures at different temperatures注：A.[P4444]CF3COO-水-脯氨酸；B.[P4448]Br-水-脯氨酸。Note:A.[P4444]CF3COO-water-Pro;B.[P4448]Br-water-Pro.

表2 不同溫度下含脯氨酸的離子液體-水混合體系的密度

2.2 氨基酸在LCST型離子液體-水混合體系中的分配規律

2.2.1 氨基酸在兩相中的分布

為了考察氨基酸在離子液體-水兩相體系中的分配情況，測定了不同溫度下5種氨基酸分別在離子液體相和水相中的濃度。如圖8所示，[P4444]CF3COO-水體系中水相氨基酸濃度遠大于離子液體相，且隨溫度升高氨基酸濃度逐漸增大，如溫度升高，甘氨酸濃度從4.58%增至6.76%。當升溫至40 ℃后，[P4444]CF3COO-水混合體系中的各類氨基酸隨水逐漸遷移至下相，這是因為，升溫使水極性增強，從而提高氨基酸溶解度[3]。[P4448]Br-水體系中，在30 ℃～60 ℃溫度范圍內，所有富氨基酸的水相均已轉移至下層，這種差異源于[P4448]Br(Mw： 339.33)分子量小，而[P4444]CF3COO-水離子液體相密度大。

圖8 不同溫度下氨基酸在離子液體-水混合體系中各相的含量Fig.8 Distribution of amino acids in the IL-water mixtures at different temperatures注：A.[P4444]CF3COO-水；B.[P4448]Br-水。Note:A.[P4444]CF3COO-water;B.[P4448]Br-water.

2.2.2 氨基酸的分配系數

分配系數可用于表示物質對兩種溶劑的親和性的差異，通常分配系數大于1表明兩相的疏水性差異利于目標提取物的分離[21]。Nazem等[22]發現在1-丁基-3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺酰)亞胺-水混合體系中，谷氨酸主要轉移到水相，色氨酸主要轉移到離子液相。這是因為谷氨酸兩個羧基與水的作用比離子液體強得多，而色氨酸的非苯環極性結構與離子液體陰、陽離子間的靜電相互作用使其更傾向于離子液體相。如圖9所示，氨基酸在離子液體-水萃取體系中的分配系數KAA均大于1，表明5種氨基酸與水的相容性更好。另一方面，5種氨基酸的KAA均隨溫度升高而增大。升溫一方面通過增強水的極性提高了氨基酸在水相的溶解度，另一方面通過增強“鹽析效應”削弱離子液體-水間的氫鍵作用，從而促進離子液體相中的氨基酸向水相遷移[16]。因此，氨基酸在離子液體-水混合體系中分配與其結構密切相關，親水性強的氨基酸更傾向于溶解在水相中(如脂肪族氨基酸)，而含疏水基團較多的氨基酸則更易與離子液體陰、陽離子發生靜電相互作用(如色氨酸)。

圖9 不同溫度下氨基酸在離子液體-水混合體系中的分配系數Fig.9 Distribution coefficients of amino acids in ionic liquid-water binary systems at different temperatures

2.2.3 氨基酸轉移的標準摩爾熱力學參數

溫度對氨基酸在離子液體-水混合體系中分配系數具有顯著影響。為了解氨基酸在離子液體-水兩相間遷移的熱力學過程，根據范霍夫方法計算了氨基酸在離子液體-水混合體系間的標準摩爾吉布斯能(△trG0m)、標準摩爾轉移焓(△trH0m)和標準摩爾轉移熵(△trS0m)，根據公式(2)～(4)進行計算[23]：

(2)

(3)

(4)

式中，KAA為氨基酸分配系數，T為溫度(K)，R是通用氣體常數(8.314 J/mol/K)，△trG0m為標準摩爾吉布斯能(kJ/mol)，△trH0m為標準摩爾轉移焓(kJ/mol)，△trS0m標準摩爾轉移熵(J/mol/K)。

表3中列出了303.15K下氨基酸在離子液體-水混合體系中的△trG0m、△trH0m和△trS0m。所有研究的體系中，△trG0m< 0且KAA> 1，表明氨基酸自發、優先分配于水相[24]。利用公式(2)對303.15 ～343.1 K溫度范圍內的ln(KAA)和1/T進行了擬合，結果所研究氨基酸的ln(KAA)與1/T呈現較好的線性關系，表明了氨基酸的△trH0m變化與溫度無關[23]。另外，焓變△trH0m< 0說明氨基酸從離子液體相向水相轉移是一個放熱過程，進一步反映了氨基酸與水的相互作用[25]。所有體系中，△trS0m> 0表明升溫使體系無序性增強，氨基酸在兩相間的遷移過程是一個熵增的過程[19]。由表3可知，△trH0m< 0，△trS0m> 0且△trH0m與T×△trS0m的值接近，所以氨基酸從離子液體相向水相轉移過程是由焓和熵共同驅動的[23]。

表3 30 ℃下氨基酸在離子液體-水混合體系中標準摩爾熱力學參數

3 結論

本文考察了氨基酸對LCST型[P4444]CF3COO-水和[P4448]Br-水混合體系相行為的影響規律。氨基酸與水的相互作用強烈，形成了與離子液體之間爭奪水分子的競爭關系，通過“鹽析效應”增強LCST型離子液體-水體系的成相能力，其促進作用趨勢為：甘氨酸 > 丙氨酸 > 賴氨酸 > 脯氨酸 > 精氨酸。此外，氨基酸主要分布在水相，隨著氨基酸添加量增加或溫度的升高，離子液體富集相和水富集相發生空間位置轉換，并且這種上、下相成分的置換是可逆的，是由焓和熵共同驅動的自發反應過程。氨基酸是離子液體-水體系良好的成相助劑，未來可以利用氨基酸的親水性差異，設計理想的液-液萃取體系實現生物分子的選擇性萃取。