微小RNA-6833-3p負調控LPIN1基因表達對肺癌細胞周期和增殖的影響

張靜宜,夏 蕾,張曉月,譚本旭,楊鎮洲

(重慶醫科大學附屬第二醫院腫瘤中心,重慶 400010;*通訊作者,E-mail:yangzz@cqmu.edu.cn)

肺癌是呼吸系統最常見的惡性腫瘤,其發病率在我國呈現逐年增加的趨勢[1,2]。肺癌預后往往較差,嚴重威脅人類生命健康[3,4]。肺癌細胞的無限增殖是肺癌發生和發展的重要原因[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類機體內源性的小分子非編碼RNA,長約22個核苷酸,具有組織特異性[6]。miRNA廣泛參與基因轉錄后水平的調節,在細胞增殖、分化、凋亡、衰老等生理過程中扮演重要角色[7]。近年來的研究發現,miRNA在肺癌組織中高表達或低表達,發揮著癌基因或抑癌基因的作用,對肺癌的發生和發展起到關鍵作用[8]。miR-6833-3p由21個核苷酸組成,可抑制結直腸癌細胞的增殖[9]。miR-6833-3p在肺癌中的作用尚不明確。本研究旨在檢測miR-6833-3p在肺癌細胞中的表達,探究miR-6833-3p對肺癌細胞周期和增殖的影響及機制,為肺癌的診斷和治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

肺癌細胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細胞(HPAEpiC)購于上海信然生物技術有限公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;RPMI-1640培養基和DMEM培養基購于美國Hyclone公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;攜帶miR-6833-3p的慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-6833-3p模擬物、miR-NC、野生型與突變型LPIN1 3′非翻譯區熒光素酶報告基因質粒(LPIN1-WT和LPIN1-MUT)購于廣州銳博生物技術有限公司;細胞周期試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司;雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒購于美國Promega公司;Lipofectamine?3000購于美國Life Technologies公司;實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;一抗CDK2、CDK4、Cyclin D1、GAPDH購于美國Abcam公司。

1.2 細胞培養和感染

HCC827、H1650、H1299肺癌細胞的培養基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,A549、HPAEpiC細胞的培養基為10%胎牛血清的DMEM培養基,培養條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。采用實時定量PCR(qPCR)檢測miR-6833-3p在肺癌細胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細胞(HPAEpiC)中的表達水平。

將H1299細胞鋪于6孔板,待細胞在6孔板中的匯合度為30%時,根據慢病毒感染說明書,分別感染攜帶miR-6833-3p的慢病毒和陰性對照慢病毒,命名為miR-6833-3p組和對照組。培養箱培養24 h后換為10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。

1.3 qPCR檢測miR-6833-3p和LPIN1 mRNA的表達

按照Trizol法提取細胞中總RNA,根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。根據qPCR試劑盒說明書進行擴增,qPCR結果以2-ΔΔCt方法得到。分別以U6和GAPDH作內參,比較miR-6833-3p和LPIN1的表達。GAPDH上游引物序列:5′-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-6833-3p上游引物:5′-TTTCTCTCTCCACTTCCTCAGGTCGT-3′,下游引物:5′-TGAGGTGCTGTGCGTGAC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;LPIN1上游引物:5′-CCAGCCCAATGGAAACCTCC-3′,下游引物:5′-AGGTGCATAGGGATAACTTCCTG-3′。

1.4 流式細胞術檢測H1299細胞周期

收集對數生長期的兩組H1299細胞,采用70%乙醇固定,在冰箱內過夜。采用PBS溶液洗3次,加入PI染液進行染色,在37 ℃下避光孵育20 min,采用流式細胞儀分析每組H1299細胞周期分布比例。

1.5 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測感染H1299細胞的增殖能力

收集對數生長期的兩組H1299細胞,分別在接種后第1,2,3,4,5天,每孔加入30 μl MTT試劑,培養箱內靜置3 h,棄上清,每孔加入160 μl二甲基亞砜,振蕩20 min,將96孔板置于酶標儀,設定波長490 nm,檢測每孔的吸光度(A)值。

1.6 生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6833-3p的潛在靶基因

利用生物信息學預測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預測miR-6833-3p的潛在靶基因可能是LPIN1。將LPIN1-WT、LPIN1-MUT與miR-6833-3p模擬物或miR-NC共轉染H1299細胞,24 h后棄去培養基,根據雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明書檢測各組H1299細胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測靶基因蛋白的表達

收集對數生長期的兩組H1299細胞,提取總蛋白并測定其濃度,等量上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳,采用濕轉法將電泳分離的蛋白轉至PVDF膜,采用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入一抗CDK2(稀釋比為1 ∶2 000)、LPIN1(稀釋比為1 ∶1 000)、CDK4(稀釋比為1 ∶1 000)、Cyclin D1(稀釋比為1 ∶500)、GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000)后4 ℃孵育。加入二抗(稀釋比為1 ∶10 000)室溫孵育2 h。加入ECL顯影液在暗室發光、顯影。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 肺癌細胞系中miR-6833-3p的表達

qPCR結果顯示,miR-6833-3p在肺癌細胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細胞(HPAEpiC)中的表達分別為0.72±0.06,0.38±0.04,0.65±0.04,0.18±0.03和1.01±0.09(見圖1)。與HPAEpiC細胞相比,miR-6833-3p在肺癌細胞中的表達均明顯下調(P<0.05),H1299細胞中的表達最低(P<0.01)。

2.2 H1299細胞感染miR-6833-3p病毒的效率

qPCR結果顯示,對照組和miR-6833-3p組細胞中miR-6833-3p的相對表達分別為1.07±0.37和12.48±1.70,miR-6833-3p組miR-6833-3p的相對表達是對照組的11.66倍,差異有統計學意義(t=6.64,P<0.01)。

與HPAEpiC比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 肺癌細胞和永生化正常肺泡上皮細胞中miR-6833-3p的相對表達Figure 1 Relative expression of miR-6833-3p in lung cancer cells and immortalized normal alveolar epithelial cells

2.3 miR-6833-3p對H1299細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示,與對照組相比,miR-6833-3p組中G0/G1期細胞比例明顯增加(P<0.01),S期和G2/M期細胞比例明顯減少(P<0.01,見圖2),miR-6833-3p可抑制肺癌H1299細胞周期的進展。

圖2 miR-6833-3p對H1299細胞周期的影響Figure 2 Effect of miR-6833-3p on the cell cycle of H1299

2.4 miR-6833-3p對H1299細胞增殖能力的影響

MTT法結果顯示,miR-6833-3p組H1299細胞在第3,4,5天的A值明顯低于對照組,差異均有統計學意義(t=2.58,P<0.05;t=3.94,P<0.05;t=5.14,P<0.01,見圖3),提示miR-6833-3p可抑制肺癌H1299細胞的增殖能力。

2.5 生物信息學軟件預測結果

利用生物信息學預測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預測,miR-6833-3p的潛在靶基因可能是LPIN1,LPIN1 3′ UTR-WT核心序列為“AGAGAGAA”,LPIN1 3′ UTR-MUT突變序列為“UCUCUCUU”(見圖4)。

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6833-3p靶向結合LPIN1

miR-NC與LPIN1-WT質粒共轉染組相對熒光素酶活性為1.01±0.09,miR-6833-3p與LPIN1-WT共轉染相對熒光素酶活性為0.36±0.08,差異有統計學意義(t=4.95,P<0.01,見圖5),表明miR-6833-3p可直接靶向結合LPIN1基因。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 miR-6833-3p對H1299細胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of miR-6833-3p on the proliferation of H1299 cells

與miR-NC+LPIN1-WT組相比,**P<0.01圖5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6833-3p靶向結合LPIN1Figure 5 Verification of the binding of miR-6833-3p to LPIN1 by dual luciferase reporter assay

2.7 H1299細胞感染miR-6833-3p慢病毒對LPIN1 mRNA表達的影響

qPCR結果顯示,感染miR-6833-3p慢病毒后的miR-6833-3p組H1299細胞中LPIN1 mRNA的相對表達量明顯低于對照組,差異有統計學意義(0.18±0.04vs1.02±0.10,t=8.04,P<0.01),表明miR-6833-3p可有效抑制LPIN1 mRNA的相對表達。

2.8 LPIN1蛋白和細胞周期蛋白的表達水平

Western blot結果表明，與對照組比較，miR-6833-3p組H1299細胞中LPIN1蛋白表達明顯降低(4.76±0.32vs2.08±0.17，P<0.01)，細胞周期蛋白CDK2表達明顯降低(7.90±0.47vs1.25±0.22，P<0.01)，CDK4表達明顯降低(2.12±0.23vs0.66±0.12，P<0.01)，Cyclin D1表達明顯降低(3.79±0.38vs1.34±0.12，P<0.01,見圖6)。

圖6 miR-6833-3p對LPIN1蛋白及細胞周期蛋白表達的影響Figure 6 Effect of miR-6833-3p on the expression of LPIN1 protein and cell cycle-related proteins

3 討論

微小RNA(miRNA)通過在轉錄后水平抑制靶基因的表達,調控細胞各種分子信號通路的轉導[10]。目前,國內外對肺癌的miRNA研究不斷深入,越來越多的miRNA在肺癌中被發現[11]。一類miRNA如miR-605-5p[12]、miR-196b-5p[5]在肺癌組織和細胞中高表達,發揮促癌功能;另一類miRNA如miR-548b-3p[13]、miR-200a-3p[14]在肺癌組織和細胞中低表達,發揮抑癌功能。有研究報道,miR-6833-3p在結直腸癌組織中的表達明顯下調,可能通過調節SMC4基因表達抑制結直腸癌細胞的增殖,發揮明顯的抑癌作用[9]。miR-6833-3p在肺癌細胞中的表達、作用及機制尚不清楚。本研究顯示,miR-6833-3p在肺癌細胞中的表達顯著少于永生化正常肺泡上皮細胞,miR-6833-3p可能與肺癌的形成密切相關。本研究采用流式細胞術檢測肺癌H1299細胞周期,上調miR-6833-3p明顯抑制H1299細胞周期進展。MTT法進一步顯示,miR-6833-3p過表達的H1299細胞增殖能力明顯降低。miR-6833-3p可通過抑制H1299細胞周期進展,降低肺癌H1299細胞的增殖能力,miR-6833-3p在肺癌細胞中發揮抑癌功能。

miRNA通過與靶基因mRNA的種子序列以不完全互補的方式結合,介導mRNA的降解,抑制靶基因的蛋白翻譯[15]。本研究利用生物信息學預測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預測發現,miR-6833-3p的潛在靶基因是脂蛋白1(lipin 1,LPIN1)。LPIN1基因位于人染色體2p25.1,由2 672個堿基組成[16]。LPIN1蛋白長度為890個氨基酸,是磷脂酸磷酸水解酶家族成員之一,負責調控脂質的合成[17]。LPIN1蛋白是一種促癌因子,在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多種實體腫瘤組織中高表達,可明顯促進腫瘤細胞的增殖,與腫瘤患者的不良預后相關[18,19]。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實,miR-6833-3p可直接與LPIN1 mRNA的3′ UTR區域互補結合。qPCR和Western blot顯示,過表達miR-6833-3p可在mRNA和蛋白水平上負向調節LPIN1基因的表達,驗證了miR-6833-3p對LPIN1具有靶向調控作用。LPIN1蛋白表達降低后,細胞周期蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1表達明顯降低,表明肺癌細胞周期進展被抑制,肺癌細胞的增殖能力降低。miR-6833-3p在肺癌組織中的表達情況尚不明確,是我們下一步的研究方向。

綜上所述,miR-6833-3p在肺癌細胞中異常表達,其通過靶向調控癌基因LPIN1的表達,抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。miR-6833-3p在肺癌細胞中發揮抑癌基因功能,其具有成為肺癌診斷和治療新靶點的潛力。