檀香提取物調控miR-199a-3p對大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用

何志凌,龍文杰,招煦杰

(1廣州中醫藥大學第二臨床醫學院心血管科,廣州 511000;2廣州中醫藥大學第一附屬醫院老年病科;3廣州中醫藥大學第二臨床醫學院重癥醫學科;*通訊作者,E-mail:vli321@163.com)

冠狀動脈再通、及時恢復缺血心肌血液供應是缺血性心臟病最常見的治療策略之一。血流的恢復可使梗死引起的損害最小化,從而降低死亡率。然而心肌再灌注損傷常引起氧化應激和炎癥反應,可能會導致額外的心血管損傷,稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[1]。目前I/R損傷的存在已成為影響心肌缺血治療效果亟待解決的重大難題。檀香是我國名貴藥材之一,據報道,檀香茶葉水提醇沉液在一定濃度時具有明顯加強衰竭離體蛙心正性肌力和增加心率作用[2]。此外,藏藥三味檀香散可能通過保護心肌線粒體結構、改善缺血心肌的能量代謝和降低心肌中一氧化氮合酶活性對大鼠心肌缺血損傷起保護作用[3]。miR-199a-3p是一種內源性短鏈非編碼RNA,最近研究表明miR-199a-3p在I/R心肌細胞中表達下調,卡維地洛可能通過上調miR-199a-3p表達對I/R心肌細胞起到保護作用[4]。此外,有研究指出miR-199a-3p可能通過不同的調控機制影響缺血預處理保護心肌I/R損傷[5]。本研究構建心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型模擬I/R損傷過程,探討檀香提取物對大鼠心肌細胞H/R損傷的影響,分析其機制是否與調控miR-199a-3p表達相關。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

大鼠心肌細胞H9c2購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫;DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司;檀香葉購于佛山綠緣生態科技有限公司;miR-199a-3p模擬物(miR-199a-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-199a-3p抑制物(anti-miR-199a-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購于上海吉凱基因公司;細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)、膜聯蛋白異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技公司;兔源活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、兔源B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司;細胞乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;miRNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green Fast qPCR Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 H/R心肌細胞損傷模型的構建

復蘇H9c2細胞后,將其接種到DMEM培養基(含10%胎牛血清)置于37 ℃、體積分數5%CO2的孵育箱中培養,選擇對數期細胞進行實驗。采用不含血清的DMEM培養基,并置于37 ℃、95% N2、5% CO2的孵育箱中培養10 h;接著更換成含10%胎牛血清的DMEM培養基,并置于條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣的孵育箱中常規培養2 h,制備H/R損傷模型[6]。

1.3 檀香提取物的制備

參照文獻[7]方法制備檀香提取物。檀香葉陰干后,將檀香葉粉碎至0.3 mm,加入80%乙醇,在料液比為1 ∶10的條件下超聲處理10 min,浸提48 h后過濾,洗滌2次,合并濾液,將濾液減壓濃縮,并冷凍干燥,即得檀香葉粗提物,用無菌水稀釋成濃度為50 mg/ml的溶液備用。

1.4 實驗分組及處理

為探究檀香提取物對H9c2細胞H/R損傷的影響,將H9c2細胞分為對照(control)組、模型(H/R)組、H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組。H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組為H9c2細胞進行H/R處理后分別加入終濃度為0.1,0.2,0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養基培養細胞24 h。采用CCK-8法檢測細胞存活率,流式細胞術檢測細胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達,試劑盒檢測LDH和CK活性,RT-qPCR試劑盒檢測miR-199a-3p表達。

為檢測miR-199a-3p對H9c2細胞H/R損傷的影響,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉染H9c2細胞,H/R處理后,依次標記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-199a-3p組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測細胞存活率,流式細胞術檢測細胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達,試劑盒檢測LDH和CK活性。

為驗證檀香提取物是通過調控miR-199a-3p表達進而影響H9c2細胞H/R損傷,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉染H9c2細胞,H/R處理后,采用終濃度為0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養基培養細胞24 h,依次記為H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測細胞存活率,流式細胞術檢測細胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達,試劑盒檢測LDH和CK活性。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

將H9c2細胞按照1×104個/孔接種于96孔板,按照上述實驗分組進行細胞處理,每孔加入10 μl的CCK8試劑,培養箱孵育4 h,酶標儀測定在450 nm處的各組細胞吸光度值(OD),計算細胞存活率。細胞存活率=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

將H9c2細胞按照2×105個/孔接種于6孔板,按照上述實驗分組進行細胞處理。收集各組細胞,用PBS重懸細胞并計數。取105個細胞,加入195 μl的Annexin Ⅴ-FITC結合液輕輕重懸細胞,加入5 μl的PI輕輕混勻,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白的表達水平

采用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白,并測定蛋白濃度。取一定體積的蛋白樣品和等體積的2×上樣緩沖液混勻,沸水浴5 min變性后冷卻至室溫備用。制備濃縮膠和分離膠,按照每孔30 μg進行上樣和聚丙烯酰胺凝膠電泳。當溴酚藍到達膠的底端處附近時停止電泳。取出凝膠,漂洗后,利用濕法轉膜裝置進行轉膜。洗膜后,按照5%脫脂奶粉封閉,洗膜,一抗(cleaved Caspase-3抗體1 ∶500稀釋,Bcl-2抗體、GAPDH抗體1 ∶10 000稀釋)孵育,洗膜,二抗(1 ∶2 000稀釋)孵育,洗膜,化學發光顯色步驟依次進行。凝膠分析系統采集圖像,以cleaved Caspase-3蛋白灰度值和內參GAPDH蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3的相對表達量。

1.8 試劑盒測定細胞培養液上清中LDH和CK活性測定

細胞按照實驗分組進行處理后,收集各組H9c2細胞上清液,2 000 r/min離心20 min后取上清液,按照試劑盒說明書測定上清液中LDH、CK活性。

1.9 RT-qPCR試劑盒檢測細胞miR-199a-3p的表達水平

細胞按照實驗分組進行處理后,采用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA,測定濃度和純度合格后,采用miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模板,利用SYBR Green Fast qPCR Mix進行qPCR擴增。miR-199a-3p上游引物:5′-CAATCGCTTTCAAATAG-3′,下游引物:5′-CAGGAGATGCTGTCATC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件為95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸35 s,35個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-199a-3p的相對表達量。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞活性及凋亡的影響

與對照組相比,H/R組H9c2細胞cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細胞cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見表1,圖1)。

圖1 檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞的細胞凋亡及相關蛋白表達的影響Figure 1 Effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表1 檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞的細胞活性及凋亡的影響

2.2 檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞受損程度及miR-199a-3p表達的影響

與對照組相比,H/R組H9c2細胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,LDH和CK活性顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細胞miR-199a-3p的表達水平顯著升高,LDH和CK活性顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞中LDH和CK含量的影響

2.3 過表達miR-199a-3p對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+miR-NC組相比,H/R+miR-199a-3p組H9c2細胞miR-199a-3p的相對水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見表3,圖2)。

表3 過表達miR-199a-3p對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

2.4 抑制miR-199a-3p表達對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+anti-miR-NC組相比,H/R+anti-miR-199a-3p組H9c2細胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05,見表4和圖3)。

表4 抑制miR-199a-3p對缺氧/復氧心肌細胞的細胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖3 抑制miR-199a-3p對缺氧/復氧心肌細胞的細胞凋亡及相關蛋白表達的影響Figure 3 Effect of inhibition of miR-199a-3p on apoptosis and expression of related proteins in hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes

2.5 抑制miR-199a-3p能逆轉檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組H9c2細胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05,見表5和圖4)。

表5 miR-199a-3p抑制和檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖4 抑制miR-199a-3p能逆轉檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響Figure 4 Inhibition of miR-199a-3p reversed the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

2.6 過表達miR-199a-3p能增強檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組H9c2細胞miR-199a-3p的相對水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達、細胞存活率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5和表6)。

圖5 過表達miR-199a-3p能增強檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響Figure 5 Overexpression of miR-199a-3p enhanced the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表6 過表達miR-199a-3p能增強檀香提取物對缺氧/復氧心肌細胞細胞活性、凋亡及受損程度的影響

3 討論

檀香又名白檀香、浴香,是全球最重要的藥用植物之一。研究顯示,檀香提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌等多方面藥理作用[7-9]。最近研究發現丹參-檀香配伍提取物對小鼠心肌缺血損傷具有一定的保護作用[10]。本研究發現H/R處理后,H9c2細胞存活率、抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低,細胞凋亡率和促凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達顯著增加,采用一定劑量的檀香提取物干預H/R處理的H9c2細胞后,心肌細胞的存活率、Bcl-2表現為明顯增加,而細胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白的表達表現為明顯降低,說明檀香提取物對H9c2細胞I/R損傷具有良好的保護作用。缺血性心臟病發生時,心肌組織中生成大量的活性氧,活性氧可直接損傷DNA,誘導細胞膜脂質過氧化和心肌細胞凋亡[11]。此外,大量的脂質過氧化產物丙二醛的釋放引起細胞膜通透性改變,破壞細胞結構,導致LDH和CK等心肌酶的大量釋放。因此,檢測細胞培養液中LDH和CK活性是評價心肌細胞受損程度的重要指標[6,12]。本研究發現H/R處理后細胞培養液中LDH和CK活性表現為顯著增加,而一定劑量的檀香提取物干預可降低H/R處理H9c2細胞培養液中LDH和CK活性。以上研究說明,檀香提取物可減輕心肌細胞損傷程度,提高心肌細胞存活率,抑制細胞凋亡,對心肌細胞H/R損傷具有保護作用。

miRNAs是機體生理和病理過程的重要調節因子,在心臟生物學和疾病中具有重要的發揮重要作用[13]。miR-199a-3p是miR-199/214簇成員之一,Chen等[14]研究表明,在心臟發生過程中miR-199a-3p表達上調,miR-199a-3p抑制劑可提高胚狀體的跳動率,促進心臟特異性標志物的表達以及干細胞向心肌細胞分化。Lesizza等[15]認為單劑量心內注射促再生性miR-199a-3p可顯著減少梗死面積,改善心肌梗死后的心臟功能。Chen等[16]研究發現,CRRL的缺失通過上調miR-199a-3p表達可促進新生大鼠內源性心肌細胞的體內外增殖,減輕心肌梗死后的重構,保護成年大鼠的心臟功能。本研究發現H/R處理后H9c2細胞中miR-199a-3p的表達顯著降低,進一步研究發現過表達miR-199a-3p可提高H/R處理H9c2細胞的活力,抑制細胞凋亡,減輕細胞損傷程度,這與Torrini等[17]和Giacca等[18]miR-199a-3p具有誘導心肌細胞增殖活性的結論基本吻合,與檀香提取物對H/R心肌細胞損傷的保護作用一致。然而抑制miR-199a-3p表達后卻加重H/R誘導的H9c2細胞損傷和凋亡。而且進一步研究顯示抑制miR-199a-3p表達能逆轉檀香提取物對H/R心肌細胞的保護作用,而過表達miR-199a-3p能增強檀香提取物對H/R心肌細胞的保護作用。以上研究說明檀香提取物通過上調miR-199a-3p表達對H/R心肌細胞發揮保護作用。然而,檀香提取物中包含黃酮類、酚類物、有機酸以及氨基酸、多肽、多糖等多種活性成分[7],探究其發揮H/R心肌細胞損傷保護作用的活性組分將是下一步研究重點。

綜上所述,本研究發現檀香提取物能通過上調miR-199a-3p表達顯著提高H/R損傷后細胞存活率,降低細胞凋亡率,減輕細胞損傷程度,對心肌細胞H/R損傷具有保護作用。