小鼠Cdc14A熒光表達載體的構建及鑒定

侯 力,孟 峻

(1內蒙古醫科大學附屬醫院臨床檢驗診斷學教研室,呼和浩特 010059;2內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:nmfrank@163.com)

細胞周期分為4個階段,即G1、S、G2、M四期,此周期由細胞調控系統控制,細胞周期蛋白依賴激酶是細胞調控系統的核心成分。此外蛋白磷酸化和脫磷酸化之間的動態平衡對細胞周期調控也是至關重要的。這些與細胞周期蛋白的合成和降解一起,決定了細胞生長和分裂的順序[1]。細胞分裂周期蛋白14A(Cdc14A)基因位于1p21染色體上,屬于雙特異性蛋白酪氨酸磷酸酶家族。它是一種重要的細胞周期調節磷酸酶,在真核生物G2期阻滯中發揮重要作用[2-4]。磷酸酶的Cdc14家族是高度保守的,并且Cdc14同源基因已經在一些生物體中被鑒定,不同物種中的Cdc14蛋白在定位和功能上有差異,在人類細胞中發現的Cdc14同源序列包括CDC14A和CDC14B(hCdc14A和hCdc14B)[5]。本實驗通過構建Cdc14A基因的熒光表達載體,為研究Cdc14A在小鼠一細胞期受精卵G2/M期轉換作用的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

目的基因通過本實驗室合成。Stbl3感受態細胞和真核表達載體pcDNA3.1-MYC-C購自廣州輝駿生物科技有限公司;HEK293細胞購自北京全式金生物技術有限公司。限制性內切酶KpnⅠ、XhoⅠ購自ThermoScientific;DMEM培養基購自GIBOC公司;微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海生工B518131-0100;質粒小量抽提試劑盒購自上海生工B518191-0050;PrimeSTAR Max Premix(2X)購自Takara R045A;TaKaRa Taq購自Takara R001B;ClonExpress Mulit One StepCloning Kit連接酶購自諾唯贊C113-2;DNA測序由生工生物工程上海股份有限公司完成。潔凈工作臺(AIRTECH,SW-OJ-2F);CO2培養箱CB115(德國WTB-binder);恒溫空氣振蕩器購自上海艾測電子科技有限公司;電泳儀(君意,JY600E)。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增目的基因 用于目的基因擴增的引物設計如下:Cdc14A-F:5′-GCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACC-3′,Cdc14A-R:5′-GTAATGAACGTATTCAGACTGAAGG-3′;mcherry-F:5′-CAGTCTGAATACGTTCATTACATGGTGAGCAAGGGC GAGGA-3′,mcherry-R:5′-GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′。

以實驗室保存的真核表達質粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A中的目的基因作為模板,用PrimeSTAR高保真酶擴增。反應體系共20 μl:模板1 μl;前向引物1 μl;反向引物1 μl;Prime STAR Max(2X) 10 μl;加入無酶水補充體系至20 μl;95 ℃預變性5 min,95 ℃變性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,進行PCR共30個循環,72 ℃延伸3 min的條件下進行PCR擴增。存放于16 ℃。成功擴增目標片段后進行凝膠電泳,與DNA marker比對,目的是確定擴增是否成功。紫外燈下,用手術刀將含有目的基因片段的凝膠條帶切取放至干凈的1.5 ml EP管中,將溶液GB加入離心管中(按100 mg凝膠加100 μl GB溶液的比例)。當水浴溫度為60 ℃時,將凝膠放置8-10 min,直到瓊脂糖凝膠完全溶解,且在水浴過程中振蕩3-5次。將其轉移到DNA純化柱中,后靜置2 min,然后12 000 r/min離心1 min,棄濾液。加600 μl漂洗液PW(Buffer PW),以12 000 r/min離心1 min,棄濾液。重復加600 μl PW漂洗液,以12 000 r/min離心1 min,棄濾液。室溫下,離心12 000 r/min 1 min。將柱子置于新的清潔1.5 ml EP管上,接著向柱中心加入35 μl 60 ℃已經提前預熱的無酶水,離心12 000 r/min 1 min以洗脫出DNA。即得到PCR產物。

1.2.2 目的片段和載體雙酶切 PCR產物15 μl用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,pcDNA3.1-MYC-C載體5 μl用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切。目的片段Cdc14A-mcherry酶切體系共50 μl:10×Buffer 5 μl;目的片段15 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;補充無酶水至總體積50 μl,37 ℃條件下進行酶切反應30 min。pcDNA3.1-MYC-C載體酶切體系共50 μl:10×Buffer 5 μl;pcDNA3.1-MYC-C空載體5 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;補充無酶水至總體積50 μl,37 ℃條件下進行酶切反應30 min。雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳30 min,在紫外燈下,用手術刀將含目的片段和載體的凝膠條帶切取,并放入無菌1.5 ml EP管中,將DNA目的片段根據DNA凝膠回收試劑盒的實驗步驟回收,具體操作可參照試劑盒說明進行。

1.2.3 目段片段與載體連接 酶切回收的PCR產物和酶切回收的載體相連接,反應體系共20 μl:酶切回收的載體pCDNA3.1-MYC-C 100 ng;酶切回收的目的片段100 ng;5×CEⅡ Buffer 4 μl;ClonExpress Mulit One Step Cloning Kit連接酶2 μl;補充無酶水至總體積20 μl,37 ℃條件下連接30 min,然后冰浴5 min。

1.2.4 連接產物轉化感受態細胞 取100 μl在冰浴中緩慢融化好的感受態細胞Stbl3于EP管中,加入連接產物10 μl,輕輕搖勻,冰浴30 min后于42 ℃水浴熱休克60 s,立即冰浴2 min后加入300 μl LB培養基,混合搖勻,在37 ℃、225 r/min振蕩培養1 h,將菌液在超干凈的工作臺中均勻地涂布在含有Amp抗生素(100 μg/ml)的LB板上,并在室溫下放置直至液體吸收。然后將倒置的平板在37 ℃生化培養箱中培養過夜。

1.2.5 菌落PCR鑒定陽性轉化子 配制菌檢PCR體系共20 μl:挑取單個菌落;上游引物1 μl;下游引物1 μl;TaKaRa Taq Max 10 μl;加無酶水補充到總體積為20 μl。按這樣的體系配制混合液,分別加到無菌的八連管內,于超凈工作臺內,選取單獨的菌落8個,做好標記;用干凈的小槍頭,輕輕碰下平板內菌落的一邊,把粘有菌的槍頭,轉移到有混合液的管子內,輕輕搖動槍頭,使菌能分散到液體內,棄掉槍頭。進行PCR擴增,反應條件:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共25個循環,72 ℃、3 min。16 ℃保存。擴增完成后,往PCR管中加入2 μl 10×loading Buffer,取10 μl樣品點樣到1%凝膠電泳,并加入5 μl Marker做參照。對照Marker大小,選取正確的菌落搖菌,測序。

1.2.6 用質粒小提試劑盒提取質粒 通過測序驗證正確的陽性克隆,安排質粒小提。將5 ml培養過夜的菌液放入干凈的離心管中,并在室溫下以12 000 r/min離心2 min,盡可能多地倒出上清液。菌體沉淀中加入250 μl Buffer P1,將菌體沉淀利用渦旋振蕩器完全懸浮;后加入250 μl Buffer P2,將離心管顛倒輕輕混合5-10次,并在室溫下靜置2-4 min,直到溶液變得清亮粘稠;后加入350 μl Buffer P3,立刻輕輕顛倒混勻5-10次,見白色沉淀物產生,在室溫下靜置2 min后,12 000 r/min離心10 min,將所有上清液移到Spin Columns中,放置2 min,以使質粒DNA完全結合到吸附柱的膜上。8 000 r/min離心0.5-1 min,棄去收集管中的液體。將500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min離心0.5-1 min,棄去收集管中的液體,重復將500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min離心0.5-1 min,再次棄去收集管內的液體,后以12 000 r/min離心2 min。將離心吸附柱Spin Columns置于無菌無酶的1.5 ml離心管中,將50-100 μl的Elution buffer加入到吸附膜的中央,并在室溫下放置2 min。以10 000 r/min離心1 min,離心管底部即質粒DNA。

1.2.7 質粒酶切鑒定 質粒雙酶切體系為20 μl:10×Buffer5 μl;pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry 2 μl;KpnⅠ 1 μl;XbaⅠ 1 μl;加無酶水補充體系至20 μl,37 ℃消化20 min。然后取6 μl 10 000 bp Marker和6 μl產物進行電泳檢測。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,選擇酶切片段大小與預期相符合的陽性克隆保存并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,質粒DNA序列測定證實pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry熒光表達載體構建成功。

1.2.8 細胞培養和轉染 在DMEM培養基(10%胎牛血清FBS,10 μg/ml鏈霉素,100 U/ml青霉素)中培養HEK293細胞。密度達到80%后,用fuGENG6轉染試劑轉染HEK293細胞。將HEK293細胞分散在100 mm培養皿中(2×106個細胞/皿,10 ml含有10%FBS培養液/皿)。將pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry轉入HEK293細胞。24 h后,細胞共轉染5 μg pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry。

1.2.9 Western blotting檢測細胞內pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的表達 熒光表達載體轉染HEK293細胞48 h后離心,收集目的細胞,提取總蛋白,檢測蛋白濃度用BCA試劑盒。配制SDS-PAGE(5%上層濃縮膠和10%下層分離膠);將蛋白樣品和適量上樣緩沖液混勻上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內,每孔上樣約50 μg蛋白質,電泳條件100 V,90-120 min;300-400 mA,30-60 min濕轉法將目的蛋白轉至PVDF膜上;PVDF膜在洗滌液中漂洗3次,每次1-2 min;用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,漂洗3次;一抗[兔來源的抗Cdc14A單克隆抗體(1 ∶200)]和β-actin抗體[兔來源的抗β-actin單克隆抗體(1 ∶1 000)]4 ℃孵育過夜,次日以TBST洗膜4遍(每遍8 min),然后辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔第二抗體(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,TBST漂洗3次;使用ECL試劑盒進行化學發光,凝膠成像檢測分析。未轉染的HEK293細胞組、用空載體pcDNA3.1-MYC-C轉染的HEK293細胞組參照轉染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293細胞組操作步驟,以anti-β-actin作為內參和anti-CDC14A抗體進行蛋白電泳檢測。

2 結果

2.1 熒光表達載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的構建及鑒定

目的片段Cdc14A-mcherry與pcDNA3.1-MYC-C載體相連接,通過測序驗證目的基因插入正確,測序結果見圖1。通過限制性核酸內切酶KpnⅠ和XbaⅠ鑒定成功構建的熒光表達載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry(見圖2)。電泳結果顯示:目的基因條帶、載體條帶與預期片段大小相符,進一步證實了細胞內質粒的身份是pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry質粒。

2.2 熒光表達載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry在HEK293細胞中的表達

Western blotting法結果顯示:轉染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry熒光表達載體的HEK293細胞裂解液在相對分子質量為97 kD附近出現清晰的條帶,未轉染的HEK293細胞、用空載體轉染的HEK293細胞則未檢測出。Western blotting法檢測結果表明:Cdc14A-mcherry融合蛋白在HEK293細胞中成功表達(見圖3)。

MYC標簽序列為GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG;ATG之后的基因序列為Cdc14A-mcherry圖1 重組質粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的測序結果Figure 1 Sequencing result of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

M.DNA marker DL10 kb;1.雙酶切(KpnⅠ和XbaⅠ)pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry質粒DNA的產物圖2 重組質粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry雙酶切結果Figure 2 Results of double restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

1.未轉染的細胞;2.空載體轉染的細胞;3.轉染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的細胞圖3 蛋白電泳檢測目的基因表達結果Figure 3 Expression of target gene by protein electrophoresis

3 討論

細胞周期進程由不同的蛋白發揮不同的功能進行調控,是一個有序的動態的過程,從而保證了生命的延續。Cdc14作為一種重要的雙特異性蛋白激酶,和其他細胞周期調節因子組成一個高度相互聯系的調控系統,在不同的生物體中發揮著重要作用。哺乳動物中Cdc14有兩種亞型:Cdc14A和Cdc14B,它們具有各自特定的作用和功能,可以與磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸殘基特異性結合,并參與了細胞內的大多數關鍵生命活動,包括細胞周期調控、減數分裂、有絲分裂等。此外,Cdc14與DNA復制、DNA損傷和DNA修復的關系也很密切[6,7],人類Cdc14A(hCdc14A)過表達會導致細胞周期一系列的功能紊亂,比如多極紡錘體,中心粒提早分離、畸形等,hCdc14A下調的表達會引起有絲分裂多種缺陷,包括姐妹染色體不分離,胞質不分裂等[8,9]。Schindler等[10]關于小鼠卵母細胞的研究表明:在生發泡(GV)期Cdc14A定位于細胞核,在生發泡破裂(GVBD)后Cdc14A聚集在凝集的染色體周圍,在第一次減數分裂的前期(MⅠ)和第二次減數分裂的中期(MⅡ)則定位于整個細胞質,同時并沒有觀察到Cdc14A與微管組織中心的γ-微管蛋白的共定位,在MⅠ到MⅡ之間Cdc14A定位于紡錘體,調節小鼠卵母細胞成熟,促進卵母細胞MⅠ/MⅡ過渡。最近有研究[11-13]表明,哺乳動物體內的CDC14A磷酸酶活性對于聽力和雄性生育是至關重要的。另外,Cdc14A可調節初級纖毛長度、調節細胞的遷移和黏附[14-16]。通過這些實驗充分證實了研究Cdc14A是很有必要的。

關于小鼠Cdc14A熒光表達載體的構建在國內未見報道,在本實驗中,首先合成帶有熒光標記的目的片段Cdc14A-mcherry,然后對目的片段Cdc14A-mcherry和載體pcDNA3.1-MYC-C進行雙酶切,最后將酶切后的目的片段和酶切后的載體相連接,經測序驗證熒光表達載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry構建成功。利用細胞轉染技術將測序驗證正確的熒光表達載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry轉染至HEK293細胞內,然后進行Western blotting,已知Cdc14A和mcherry蛋白的相對分子質量分別為67 kD及30 kD,而轉染重組質粒pc-DNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293細胞組在相對分子質量為97 kD附近出現清晰的蛋白電泳條帶,提示利用Cdc14A抗體檢測的特異性條帶為Cdc14A-mcherry融合蛋白。結果表明轉染HEK293細胞內的目的片段成功表達。此實驗為Cdc14A后續的相關研究奠定了良好基礎。