雌、孕激素通過TGF-β影響宮腔粘連的形成

陳 慶,趙金燕,張 雪,公丕軍,趙 艷,薛 翔

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:xgxue@263.net)

宮腔粘連(intrautine adhesion,IUA)也被稱為Asherman綜合征,1948年由Asherman首次報道,其臨床表現為周期性下腹痛、月經量減少、閉經、反復流產及不孕等癥狀[1]。IUA主要由子宮內膜基底層損傷引起,導致宮腔粘連或瘢痕形成,宮腔或宮頸管部分或完全閉塞[2]。近年來,隨著子宮手術操作的增多,宮腔粘連的發生率在我國呈上升趨勢[3],IUA已成為一個導致女性不孕的主要因素。

雖然人們對IUA的病因有所認識,但對于IUA的具體形成機制仍不清楚。雌激素和孕激素是由卵巢分泌的兩種類固醇激素,它們在調節子宮內膜細胞增殖及維持子宮內膜正常結構和功能方面具有重要作用[4,5]。研究發現,雌、孕激素受體(ER/PR)與宮腔粘連的發生密切相關[6,7],并且雌激素、孕激素治療能增加子宮內膜的厚度和體積,臨床上也已采用雌激素作為宮腔粘連分離術預防粘連復發的手段[8]。但雌、孕激素是否影響宮腔粘連的發生及其內在機制,目前尚無報道。因此,本研究探討雌、孕激素在IUA形成中的作用及機制,對于宮腔粘連的防治具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

ER兔抗人多克隆抗體、PR兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司;TGF-β、β-actin購自美國Santa Cruz公司;羊抗兔SP試劑盒(武漢博士德公司)。苯甲酸雌二醇(上海通用藥業),黃體酮(廣州明興制藥廠)。

1.2 組織標本

96例宮腔粘連組織標本收集于西安交通大學第二附屬醫院婦產科2011年1月至2013年1月因宮腔粘連行宮腔鏡下粘連松解術的患者,年齡21-43歲,30例正常子宮內膜組織收集于同期因不孕行宮腔鏡檢查的非IUA患者,年齡20-43歲,平均(28.5±1.6)歲,標本均取自增殖期子宮內膜組織。實驗前患者已簽署知情同意書,并取得西安交通大學第二附屬醫院醫學倫理委員會的批準(2019-倫審-研第020號)。納入標準:①經宮腔鏡檢查確診的宮腔粘連患者;②年齡≥20歲;③知情同意并自愿參加研究者。排除標準:①近3個月使用雌、孕激素或促性腺激素釋放激素類似物等激素類治療;②懷孕或授乳;③有功能性子宮出血、子宮腺肌癥、子宮內膜息肉、子宮內膜異位癥、子宮平滑肌瘤。其中一部分標本中性福爾馬林固定,石蠟包埋,以備免疫組化檢測ER、PR,另一部分標本液氮保存,以備Western blot檢測ER、PR及TGF-β。

1.3 免疫組化檢測及結果判定

采用免疫組化SP法檢測,嚴格安照試劑盒說明書步驟操作。陰性對照以PBS代替一抗。免疫組化結果判定,依據陽性細胞數和染色強度綜合評分[9]。

在油鏡下,按陽性細胞百分比分為5個等級:<10%為0分,10%-25%為1分,25%-50%為2分,50%-75%為3分,≥75%為4分;按染色強度分為4個等級:無著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,黃褐色為3分。最終評分按如下公式計算:免疫反應評分(immunoreactivity score,IRS)=陽性細胞百分比評分×染色強度評分。最后總評分>3定義為陽性染色。

1.4 Western blot檢測ER、PR及TGF-β表達

提取組織或細胞蛋白,BCA法蛋白定量,用SDS-PAGE分離,濕式轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗(ER兔抗人多克隆抗體1 ∶200;PR兔抗人多克隆抗體1 ∶200;TGF-β兔抗人多克隆抗體1 ∶300)于4 ℃下孵育過夜,室溫下,TBST洗滌,10 min×3次,辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG(1 ∶10 000)室溫下孵育1 h。增強化學發光(ECL),X膠片顯影、定影。采用Quantity One軟件進行灰度分析。

1.5 動物模型制備

選擇9-11周齡的健康普通級新西蘭雌兔24只,體質量2 000-2 800 g。常規單籠飼養適應環境1周后,隨機分為4組:正常生理組、低雌低孕組、低雌高孕組和高雌低孕組,每組6只。低雌低孕組為切除雙側卵巢,正常生理組僅切除雙側卵巢周圍的脂肪等組織,低雌高孕組為切除雙側卵巢后立即開始給予1.0 mg黃體酮,高雌低孕組為切除雙側卵巢后立即開始給予1.0 mg苯甲酸雌二醇,肌內注射,2次/周,持續4周。低雌低孕組和正常生理組,給予注射生理鹽水。

兩周后在3%戊巴比妥鈉麻醉下,縱行剖開雌兔雙側子宮宮體部,右側宮腔于子宮內膜與肌層交界處用自制的刮勺盡量刮除內膜組織,并于被搔刮宮體的遠端縫扎、切斷剩余的宮體,以避免術后遠端內膜爬行;左側宮腔僅暴露內膜,不行搔刮。術后縫合雙側宮腔至正常形態。繼續原方案用藥2周,并常規使用抗生素3 d預防感染。3%戊巴比妥鈉麻醉,空氣栓塞處死,采集子宮內膜組織,4%甲醛固定,以備HE、Masson染色。

1.6 伊紅-蘇木素(H&E)及Masson染色

子宮內膜組織用4%甲醛固定,石蠟包埋,之后采用蘇木精-伊紅和Masson常規染色。參照以下標準進行閱片。HE評分標準[10]:①以正常生理組高倍鏡視野下所含子宮內膜腺體數目,計為0分;②隨機選取右側子宮內膜切片的4個視野,讀取每高倍鏡視野下子宮內膜腺體數目并求均值,如腺體數目相對于正常雌孕激素組減少1%-10%,計1分;減少11%-25%,計2分;減少26%-50%,計3分;減少51%-75%,計4分;減少76%-100%,計5分;(3)類比于以上標準,如腺體數目增加則分別計為-1、-2、-3、-4、-5分。Masson評分標準[10]:①以正常生理組高倍鏡視野下子宮內膜中所含膠原纖維成分比例為標準,計為0分;②隨機選取各組兔右側(即搔刮側)子宮內膜切片4個視野,讀取每高倍鏡視野下子宮內膜中膠原纖維所占比例,如膠原纖維所占比例相對于正常雌孕激素組增加1%-10%,計1分;增加11%-25%,計2分;增加26%-50%,計3分;增加51%-75%,計4分;增加76%-100%。計5分;③類比于以上標準,如膠原纖維所占比例減少則分別計為-1、-2、-3、-4、-5分。

子宮內膜纖維化包括腺體減少和膠原纖維增加兩個變量,將每只動物HE和Masson染色評分結果相加,即得出子宮內膜纖維化的半定量評分,評分越高提示內膜纖維化程度越重。

1.7 細胞培養

子宮內膜癌細胞株RL95-2購自中科院上海細胞研究所,采用DMEM高糖培養基,置于含5% CO2的37 ℃培養箱中培養。將細胞分為4組,即對照組(Con)、低雌低孕組(LE+LP)、低雌高孕組(LE+HP)和高雌低孕組(HE+LP)。其中,低雌低孕組給予雌、孕激素各2 nmol/L,低雌高孕組給予2 nmol/L雌激素和15 nmol/L孕激素,而高雌低孕組給予15 nmol/L雌激素和2 nmol/L孕激素。培養72 h后,收獲細胞,提取蛋白于-80 ℃保存。

1.8 統計分析

2 結果

2.1 ER、PR在宮腔粘連組織中的表達

免疫組化染色顯示,ER及PR主要表達在細胞核(見圖1),ER在正常子宮內膜及宮腔粘連組織中的陽性率分別為40.0%(12/30)及18.8%(18/96);PR在正常子宮內膜及宮腔粘連組織中的陽性率分別為20.0%(6/30)及34.4%(33/96),經卡方檢驗,差異均具有統計學意義(P<0.01)。進一步Western blot檢測結果表明,ER在宮腔粘連組織中的表達明顯低于正常子宮內膜組織(0.28±0.04vs0.68±0.03),PR在宮腔粘連組織中的表達則明顯高于正常子宮內膜組織(1.47±0.06vs0.51±0.04),半定量分析后,經t檢驗,差異均有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

圖1 ER和PR在IUA組織中的表達 (免疫組化染色,×40)Figure 1 the expression of ER and PR in IUA tissues (HE,×40)

2.2 雌、孕激素對子宮內膜纖維化的影響

各組雌兔體內雌、孕激素水平有明顯差異,經方差分析,差異具有統計學意義(P<0.01,見表1)。

表1 給藥兩周后兔血清中E2和P的水平

通過HE及Masson染色,兔子宮內膜纖維化評分顯示,與正常生理組及低雌低孕組相比,低雌高孕組呈明顯升高,而高雌低孕組呈明顯降低,經方差分析,差異均具有統計學意義(P<0.01,見圖3)。

與正常子宮內膜比較，*P<0.05圖2 Western blot檢測ER和PR在IUA組織中的表達Figure 2 Expression of ER and PR in IUA tissues measured by Western blot

2.3 TGF-β在宮腔粘連組織的表達

Western blot檢測顯示,與正常子宮內膜相比,TGF-β在宮腔粘連組織中的表達明顯升高的,差異有統計學意義(P<0.01,見圖4)。采用Pearson相關分析ER和PR與TGF-β表達的相關性,結果發現在宮腔粘連組織中TGF-β與ER的表達呈負相關(r=-0.88,P<0.01),而與PR的表達呈正相關(r=0.81,P<0.05,見圖5)。

與正常正常生理組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 雌、孕激素對兔子宮內膜纖維化的影響 (×40)Figure 3 Effect of estrogen and progeston on the endometrial fibrosis of rabbits (×40)

與正常子宮內膜組織相比,*P<0.05圖4 Western blot檢測TGF-β在正常子宮內膜及IUA組織的表達Figure 4 Expression of TGF-β in normal endometrial and IUA tissues by Western blot

圖5 TGF-β與ER、PR在IUA組織表達的相關分析Figure 5 Correlation analysis between TGF-β and ER, PR in IUA tissues

2.4 雌、孕激素對TGF-β在子宮內膜細胞表達的影響

通過對RL95-2細胞分別給予不同劑量的雌、孕激素刺激72 h后,Western blot檢測顯示,與對照組相比,低雌高孕組RL95-2細胞中TGF-β的表達出現了明顯升高,相反,高雌低孕組則出現了明顯降低,灰度分析后,差異有統計學意義(P<0.05,見圖6)。

與對照組相比,*P<0.05圖6 Western blot檢測雌孕激素對TGF-β在RL95-2細胞中表達的影響Figure 6 Effect of estrogen and progeston on the expression of TGF-β in RL95-2 cells by Western blot

3 討論

機械損傷或感染性損傷是IUA發生的主要危險因素,目前宮腔鏡下經宮頸粘連松解術是臨床治療IUA的首選方案[11]。然而,術后粘連復發率仍較高,尤其是重癥IUA的復發率高達20%-62%[12]。因此,闡明IUA形成的分子機制具有重要意義。

ER、PR作為與女性生殖內分泌調節有關的重要物質,與子宮內膜的修復密切相關,在子宮全層中均有表達[13]。本研究首先通過免疫組化及Western blot檢測發現,ER在IUA組織中呈低表達,PR在IUA組織中呈高表達,這一結果提示ER及PR可能與IUA的形成有關。雌、孕激素通過特異性識別ER和PR,與ER、PR結合形成的二聚體將激素信號轉化成一系列的化學反應,最終調節基因轉錄、蛋白質合成以及維持子宮的正常功能[14]。為探討雌、孕激素在IUA形成中的作用,本研究通過動物實驗發現,低雌高孕組子宮內膜纖維化評分與正常生理組及低雌低孕組相比明顯升高,而高雌低孕激素組則明顯降低,這表明低雌高孕激素能促進雌兔子宮內膜纖維化,相反,高雌低孕激素則抑制雌兔子宮內膜纖維化,這表明雌、孕激素在IUA形成中具有重要作用,但其作用可能相反。

TGF-β作為TGF家族中的一員,是目前已知最重要的促纖維形成細胞因子,可由多種細胞產生。TGF-β對細胞的生長、分化、遷移、凋亡及細胞外基質的生成均具有調節作用,已經成為細胞纖維化的重要標志[15]。研究發現,TGF-β在許多子宮內膜相關性疾病的發生中起重要作用,如子宮內膜異位癥[16]、子宮內膜癌[17]等。本研究通過Western blot檢測發現,TGF-β在IUA組織中呈高表達,這與以往研究相一致[18,19]。Pearson相關分析發現,在宮腔粘連組織中TGF-β與PR的表達呈正相關,與ER的表達呈負相關。這一結果提示TGF-β表達可能與雌、孕激素有關。為了進一步驗證雌、孕激素對TGF-β表達的影響,通過體外細胞培養發現,與對照組相比,低雌高孕激素處理可引起RL95-2細胞中TGF-β表達升高,而高雌低孕激素處理則導致RL95-2細胞中TGF-β的表達降低,這表明雌孕激素影響TGF-β在子宮內膜細胞的表達。

綜上所述,本研究表明雌、孕激素可能在IUA的發生、發展中起重要作用,雌激素能抑制宮腔粘連的形成,而孕激素則促進宮腔粘連的形成,其機制與TGF-β的表達有關。這為宮腔粘連的臨床治療提供了一個潛在靶點,由于雌、孕激素在體內的作用是復雜的。因此,其具體的分子機制尚需今后進一步研究。