14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿的合成及生物活性研究

黨 雯,侯宏保

(1山西醫科大學第二醫院藥學部,太原 030001;2山西醫科大學藥學院;*通訊作者,E-mail:27780042@qq.com)

癌癥成為了世界范圍內威脅人類健康最嚴重的疾病之一,據估計,到2030年,全球癌癥死亡人數將超過1 140萬[1]。因此,全球對抗癌藥物的需求正在上升。2020年以來,抗癌藥物銷售額達到1 500億美元,在各類藥物中排名首位。因此,癌癥的流行及其對現有治療藥物的耐藥性要求開發新藥,以克服現有藥物的局限性[2,3]。

超過200種化療藥物已被FDA批準用于治療癌癥,其中75%來自天然產物[4,5]。隨著人們對抗腫瘤藥物的深入研究,發現天然藥物在抗癌藥物中起重要作用,大約三分之二的抗腫瘤藥物是發現的天然產物來源或衍生分子[6,7]。其中通過對天然活性成分的結構進行修飾改造,克服其局限性,從而發現新的高效低毒的抗腫瘤藥物,已經成為了一條有效的途徑。

粉防己堿(tetrandrine,Tet)是一種典型的二芐基異喹啉類生物堿,具有多種生物活性,包括抗炎、抑制腫瘤增殖、免疫調節等。還作為一種具有多種作用機制的潛在抗癌藥物,能抑制腫瘤細胞的增殖,增加化療藥物的敏感性,逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR)[8]。其中,Tet可誘導多種腫瘤細胞凋亡,包括人肺癌細胞、肝癌細胞、白血病細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、人乳腺癌細胞等[9,10]。文獻研究顯示,粉防己堿的結構修飾報道較少,改造主要是在C-5和C-14位置引入鹵素再構建C-C或C-N鍵,制備異喹啉單元的季銨鹽[11-13]。在這項研究中,為豐富粉防己堿衍生物的結構多樣性和獲得更好的抗癌候選藥物,以粉防己堿為原料,依次經硝化、還原反應,獲得關鍵中間體14-氨基粉防己堿,采用Chan-Lam-Evans偶聯法再將其與硼酸類化合物合成了新型粉防己堿衍生物[14-17]。利用HL7702和HepG2細胞對新合成的粉防己堿衍生物進行生物活性評價。本文還對其抗肝癌HepG2細胞活性最強的化合物的遷移侵襲能力進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀;ZF-I型三用紫外分析儀;Bruker AVANCE 600 MHz型超導核磁儀(TMS為內標);Bruker AV-Ⅲ 400 MHz超導核磁共振波譜儀;Bruker ESI-QTOF型液質聯用儀。

粉防己堿購自南京道斯夫生物科技有限公司;催化劑、配體均購自百靈威科技有限公司;實驗用水為國藥集團產蒸餾水;其他化學試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

HepG2細胞、HL2202細胞由中國科學院上海藥物研究所提供。

1.2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿的合成

1.2.1 中間體C-14-硝基粉防己堿、C-14-氨基粉防己堿的合成 在惰性氣體氮氣保護下,溫度為-10 ℃時,將HNO3(69%,1.2 ml,19.2 mmol)緩慢滴加到(CH3CO)2O(3.0 ml,32.0 mmol)的溶液中,繼續攪拌20 min。待混合液溫度至室溫后,滴加溶解于CH2Cl2(5 ml)中的粉防己堿(1.0 g,1.6 mmol)中,在-5 ℃下反應6.5 h,反應過程中用薄層色譜法對反應進程進行監測,反應結束后,用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應原液,用CH2Cl2(3×20 ml)萃取,用無水硫酸鈉干燥,過濾。溶劑在減壓下被除去,以CH2Cl2/MeOH(50/1,V/V)混合溶液為洗脫劑,經硅膠柱層析純化,得到化合物C-14-硝基粉防己堿(見圖1)。

將C-14-硝基粉防己堿(1.0 g,1.5 mmol)與鈀(10%,100 mg)碳加氫催化劑的混合物加入水合肼(85%,1.65 ml,45.0 mmol)的無水甲醇(30 ml)中,在80 ℃攪拌。反應在2 h內完成。混合物冷卻至室溫,過濾除去催化劑。濾液采用減壓旋轉蒸發法進行蒸發。用CH2Cl2稀釋殘渣,用水清洗,在無水硫酸鎂上干燥,過濾。溶劑在減壓下被除去。原油由石油醚和丙酮(1/3,V/V)重結晶得到化合物C-14-氨基粉防己堿(見圖1)。

圖1 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿的合成路線Figure 1 The synthetic routes of 14-N-(3-acetylphenyl)-amino-tetrandrine

1.2.2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿的合成及鑒定 將中間體C-14-氨基粉防己堿(0.16 mmol,100 mg)、3-乙酰基苯硼酸(0.32 mmol,52.47 mg)、醋酸銅(0.32 mmol,63.89 mg)和吡啶(0.24 mmol,19.98 ml)在室溫下進行“一鍋化”反應。在干燥的氧氣中攪拌12-24 h反應終止。用氨水淬滅反應,過濾,用CH2Cl2萃取3次。無水硫酸鈉干燥,過濾,溶劑在減壓下被除去。用硅膠層析法從CH2Cl2/MeOH(50/1,V/V)中分離得到產物(見圖1)。

14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿:黃褐色固體85.57 mg;產率:70.8%;熔點:142.7-143.3 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H),7.25(dd,J=8.9,2.5 Hz,2H),7.20(d,J=5.0 Hz,1H),7.15(dd,J=8.1,2.5 Hz,1H),7.08(d,J=7.7 Hz,1H),6.95(s,1H),6.60(dd,J=8.4,2.5 Hz,1H),6.55-6.46(m,1H),6.42(d,J=5.2 Hz,1H),6.24(d,J=5.3 Hz,1H),6.10(dd,J=8.5,1.8 Hz,1H),5.84(d,J=9.4 Hz,1H),3.95-3.85(m,2H),3.85-3.78(m,3H),3.67(d,J=3.2 Hz,3H),3.61-3.49(m,2H),3.44(d,J=5.7 Hz,2H),3.30(d,J=3.3 Hz,3H),3.05(d,J=8.7 Hz,3H),2.57(m,3H),2.45(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ197.5,162.2,154.9,150.9,148.2,147.9,147.3,145.0,143.3,142.9,137.4,137.0,135.3,132.4,131.8,128.8,128.5,126.7,126.3,125.0,120.7,120.3,120.2,119.8,118.3,117.3,113.3,111.3,111.2,104.8,102.7,63.1,60.8,60.1,59.1,55.4,54.7,54.6,43.8,42.1,41.0,39.9,38.6,37.7,30.9,28.7,28.3,25.8,23.4,21.7,19.6。HRMS(ESI-TOF)m/z:756.37{[M+H]+},計算得C46H49N3O7。紅外:3 356,2 942,2 831,1 453,1 021 cm-1。

1.3 抗腫瘤活性

1.3.1 抗腫瘤活性MTT測試 取處于對數生長期,生長狀態良好的HepG2、HL7702細胞,以5×106個/孔接種于96孔板,分別標記為HepG2、HL7702細胞組,同時設空白組,37 ℃培養過夜(在細胞孔周圍孔內加入100 μl無菌PBS),作用24,48,72 h。每孔加入10 μl(5 mg/ml)MTT,37 ℃培養4 h;吸出培養基,加入150 μl DMSO震蕩10 min;酶標儀測定568 nm下的各孔吸光值(OD值)。對照組存活率記為100%。

1.3.2 細胞劃痕實驗檢測14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響 marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔0.5-1 cm一道,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線;取處于對數生長期,生長狀態良好的HepG2細胞;用PBS清洗細胞,去除劃下的細胞,加入無血清培養基,同時拍取0 h照片;放入培養箱培養48 h后拍照;本操作依據參考文獻進行[18]。

1.3.3 細胞侵襲實驗檢測14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響 取處理好的HepG2細胞,加入PBS清洗細胞,胰酶消化收集離心,去上清。無血清MEM培養基重懸細胞,細胞計數板計數。結晶紫染液染色,室溫中放置20 min,PBS清洗,用干凈的棉球將上室一側的未遷移的細胞擦干凈,顯微鏡下觀察拍照;本操作依據參考文獻進行[19]。

1.3.4 統計學分析 使用SPSS 22對不同組間體外藥效學的差異進行比較,采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗(方差齊)和非參數檢驗(方差不齊)進行分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物活性

MTT法體外抗腫瘤活性測試結果表明:該化合物對所測腫瘤細胞有不同程度的增殖抑制作用(見表1)。

表1 不同化合物對腫瘤細胞及正常細胞的抑制作用

結果顯示,合成的14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞有抑制活性,化合物(IC50=4.61 μmol/L)對肝癌HepG2細胞的IC50值遠低于先導化合物粉防己堿(IC50=10.98 μmol/L)。

2.2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞生存率的影響

采用MTT法評價14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞生存率的影響,使用不同濃度的14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿作用于HepG2細胞24,48,72 h后,對細胞的的生長抑制作用結果見表2。14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖(見圖2)。在24,48,72 h的IC50值分別為7.25,4.61,2.98 μmol/L。

圖2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞生存率的影響Figure 2 Effects of 14-N-(3-acetylbenzene)-amino tetrandrine on survival rate of HepG2 cells

表2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿抑制HepG2細胞增殖的作用

2.3 劃痕實驗檢測14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響

倒置顯微鏡觀察化合物作用48 h后HepG2細胞劃痕細胞面積的差異,結果見圖3。劃痕實驗證實14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿抑制HepG2細胞遷移能力,0 μmol/L干預組0 h和48 h遷移距離分別為(51±4.1)μm和(181±4.6)μm,1 μmol/L干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(50±2.4) μm和(168±6.3)μm；2 μmol/L干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(52±1.3)μm和(135±2.1)μm；4 μmol/L干預組干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(53±1.9)μm和(50±5.3)μm。不同濃度作用后遷移距離差異有統計學意義(P<0.05)。表明14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿能夠抑制HepG2細胞的遷移能力,且呈濃度依賴性。

2.4 Transwell實驗檢測14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞侵襲力的影響

0 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數量為(40±1)個,2 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數量為(20±2)個,4 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數量為(11±1)個,6 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數量為(3±1)個,不同濃度干預后通過膜過濾器的遷移細胞數量差異具有統計學意義(P<0.05)。提示14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞的侵襲能力表現出明顯的抑制作用,且呈濃度依賴性。

圖4 Transwell實驗分析14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞侵襲的影響 (倒置顯微鏡,×200)Figure 4 Effects of 14-N-(3-acetylbenzene)-amino tetrandrine on invasion of HepG2 cells by Transwell (inverted microscope,×200)

3 討論與結論

以粉防己堿為先導化合物,經過中間體C14-硝基粉防己堿、C14-氨基粉防己堿,再經Chan-Lam-Evans反應合成了粉防己堿衍生物,并通過HRMS、1H NMR、13C NMR等技術手段進行了表征。采用MTT法對衍生物進行體外細胞增殖活性篩選,細胞劃痕實驗和Transwell侵襲結果均表明,14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞有較好的生物活性;此外,14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿(IC50=4.61 μmol/L)對HepG2細胞的毒性是粉防己堿原料藥對HepG2細胞毒性的2.38倍和阿霉素對HepG2細胞毒性的2.91倍。由于14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞的抑制效果較好,進一步設置4個濃度分別進行干預,發現化合物可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖。

進一步的研究表明,14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿具有明顯抑制肝癌細胞HepG2遷移和侵襲的能力。以上實驗設計合成及初步活性探究結果可為進一步通過結構優化尋求更加有效的抗腫瘤化合物提供參考。