常壓室溫等離子體誘變選育產(chǎn)單寧酶炭黑曲霉及發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

董弦弦,吳曉江,張鈺龍,巫小丹,萬茵,劉成梅,付桂明*

1 (食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué)),江西 南昌,330000)2 (南昌大學(xué) 食品學(xué)院,江西 南昌,330000)3 (南昌大學(xué) 國際食品創(chuàng)新研究院,江西 南昌,330000)

單寧酶(tannase,EC 3.1.1.20),又稱單寧酰基水解酶,可以催化水解單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵生成葡萄糖、沒食子酸等化合物[1-2],被廣泛應(yīng)用于食品、動(dòng)物飼料、速溶茶、釀造、制藥等工業(yè)領(lǐng)域[3-6]。單寧酶是一種胞外誘導(dǎo)酶,由真菌、細(xì)菌等多種微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生,如GOVINDARAJAN等[7]使用陰溝腸桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶,并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化,其單寧酶酶活力為2.26 U/mL；SHARMA等[8]以茶渣作為發(fā)酵底物,使用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶,30 ℃下培養(yǎng)96 h后,單寧酶酶活力達(dá)1.86 U/g,并探究其在番石榴汁中的應(yīng)用。目前主要選擇絲狀真菌作為單寧酶的工業(yè)化生產(chǎn)菌株,但存在產(chǎn)酶活力低、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)[9]。因此,采用誘變選育技術(shù)提高菌株單寧酶產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的可行途徑。常見的誘變方法有紫外誘變[10]、N+注入[11]、甲基磺酸乙酯[12]等,但這些誘變方法存在對操作人員有危害、突變庫容量小、菌種遺傳穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。

常壓室溫等離子體 (atmospheric room temperature plasma,ARTP)是一種新型微生物誘變育種技術(shù)[13],具有安全性高、突變率高等優(yōu)勢,目前已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、真菌、微藻等近60種微生物[14]。例如,LIU等[15]采用ARTP誘變技術(shù)與實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合的方法,提高了凝結(jié)芽孢桿菌的pH耐受性和細(xì)胞膜通透性；毛斌等[16]為獲得高產(chǎn)中性蛋白酶菌株,使用ARTP對米曲霉進(jìn)行處理,篩選得到1株高產(chǎn)突變株,其中性蛋白酶活力提高21.0%。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得的1株產(chǎn)單寧酶能力較強(qiáng)的炭黑曲霉AspergilluscarbonariusFCYN212為研究對象,進(jìn)行ARTP誘變選育高產(chǎn)單寧酶菌株,并利用5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化,為單寧酶的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及在食品發(fā)酵中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發(fā)菌株：炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)FCYN212(GenBank No.KX912228)由本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato detrose agar,PDA)培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯,加入1 L水,煮沸20 min,冷卻過濾后補(bǔ)足水至1 L,加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂,pH自然。121 ℃ 20 min滅菌。

初篩培養(yǎng)基：3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4·7 H2O、30 g蔗糖、0.04 g溴酚藍(lán)、10 g單寧酸,蒸餾水1 L,調(diào)節(jié)pH 至4.5～5 (固體培養(yǎng)基外加30 g瓊脂)。121 ℃ 15 min滅菌。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4·7 H2O、30 g蔗糖,調(diào)pH為5.0；添加10 g單寧酸。121 ℃ 15 min滅菌。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SP-756P可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；ARTP-Ⅱ型ARTP誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司；BioCore QF-5全自動(dòng)發(fā)酵罐,上海楚怡生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將炭黑曲霉A.carbonariusFCYN212接種于PDA斜面培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng) 4 d,用預(yù)先滅菌的0.9%的生理鹽水沖洗孢子,得到單孢子懸液。

1.2.2 炭黑曲霉生長時(shí)間與產(chǎn)單寧酶關(guān)系

將1 mL孢子懸浮液(108CFU/mL)接種到液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24、48、72、96、120 h,抽濾菌絲,105 ℃烘干至恒重；發(fā)酵液4 ℃透析后,測定胞外單寧酶酶活力[17]。

1.2.3 ARTP誘變

將10 μL炭黑曲霉菌懸液涂布于無菌金屬載片上,設(shè)置處理功率120 W,氣量10 SLM,誘變處理時(shí)間分別為60、120、180、210、240、300、360 s。將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中,振蕩1 min。取100 μL稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)4 d,以未經(jīng)ARTP處理的懸浮液作為對照。計(jì)算不同處理時(shí)間的致死率,如公式(1)所示：

(1)

式中：A,菌液處理時(shí)間0 s(對照組),稀釋涂布菌落計(jì)數(shù)；B,菌液處理一定時(shí)間(實(shí)驗(yàn)組),稀釋涂布菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 初篩

將誘變后的菌懸液,稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基,測定菌落周圍顯色圈直徑(H)與菌落直徑(D),以H/D值衡量菌株產(chǎn)單寧酶能力。

1.2.5 復(fù)篩

選取H/D值較大的菌株,按照1.2.2的方法進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩,篩選出產(chǎn)單寧酶能力提高的突變菌株。

1.2.6 單寧酶活性的測定

參考MONDAL等[17]的檢測方法。酶活力定義：每分鐘水解1 μmol單寧酸底物所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位 (U)。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩得到的突變株在初篩斜面培養(yǎng)基中28 ℃連續(xù)傳代8次,液態(tài)發(fā)酵測定傳代后菌株產(chǎn)酶能力。

1.2.8 炭黑曲霉突變株發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以單寧酶酶活力為評價(jià)指標(biāo),以誘導(dǎo)物濃度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、溶氧量、誘導(dǎo)物添加時(shí)間為單因素變量,利用全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.8.1 種子液培養(yǎng)

按照1.2.2的方法,培養(yǎng)2 d為種子液,將種子液按照體積分?jǐn)?shù)1%接種于全自動(dòng)發(fā)酵罐中,進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化。

1.2.8.2 誘導(dǎo)物濃度對突變株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以單寧酸為誘導(dǎo)物,改變其質(zhì)量濃度為20～70 g/L,設(shè)置轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)溫度28 ℃、溶氧濃度按體積分?jǐn)?shù)控制為40% (溶氧濃度與轉(zhuǎn)速、氣體偶聯(lián)),接種后發(fā)酵3 d,測定發(fā)酵液中酶活力,確定最優(yōu)濃度。

1.2.8.3 接種量對突變株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

按照上述優(yōu)化后發(fā)酵參數(shù),將接種量(體積分?jǐn)?shù))設(shè)置為0.5%、1%、2%、3%、4%,發(fā)酵完成后,測定發(fā)酵液中酶活力,確定最優(yōu)接種量。

1.2.8.4 發(fā)酵時(shí)間對突變株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

按照上述優(yōu)化后發(fā)酵參數(shù),于2、3、4、5 d取樣,測定發(fā)酵液中酶活力,確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

1.2.8.5 溶氧體積分?jǐn)?shù)對突變株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

設(shè)置溶氧體積分?jǐn)?shù)為30%、35%、40%、45%、50% (溶氧體積分?jǐn)?shù)與轉(zhuǎn)速、氣體偶聯(lián)),按照上述優(yōu)化后參數(shù),發(fā)酵完成后,測定發(fā)酵液中單寧酶酶活力,確定最優(yōu)溶氧體積分?jǐn)?shù)。

1.2.8.6 誘導(dǎo)物添加時(shí)間對突變株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

按照上述優(yōu)化后參數(shù),設(shè)置誘導(dǎo)物添加時(shí)間為24、36、48、60 h,發(fā)酵完成后,測定發(fā)酵液中酶活力確定最優(yōu)添加時(shí)間。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 9.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)間具有顯著差異。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭黑曲霉生長時(shí)間與產(chǎn)單寧酶關(guān)系

如圖1所示,炭黑曲霉在培養(yǎng)48 h后進(jìn)入對數(shù)生長期末期,此時(shí)酶活力增加最快；在培養(yǎng)96 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)酶活力最高達(dá)到了(0.095 3±0.003 6) U/mL,趨于穩(wěn)定。對數(shù)生長期的菌體生長活躍、細(xì)胞密度大,能提高誘變效率[18]。因此選擇生長48 h的菌體進(jìn)行誘變處理,選擇培養(yǎng)96 h作為酶活力對比的時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行后續(xù)篩選工作。

圖1 炭黑曲霉生長時(shí)間與產(chǎn)單寧酶關(guān)系

2.2 炭黑曲霉致死率

炭黑曲霉致死率如圖2所示。菌體的致死率在前120 s急劇上升,處理120 s時(shí)致死率接近90%;處理120～240 s時(shí),呈現(xiàn)逐漸平穩(wěn)的趨勢,這可能是因?yàn)槲⑸锏淖晕倚迯?fù)功能發(fā)揮作用,此時(shí)易發(fā)生回復(fù)突變；處理420 s致死率接近100%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)致死率處于85%～95%時(shí),可獲得最大程度的正突變[19],結(jié)合正突變率曲線,選擇誘變時(shí)間為180 s。

圖2 ARTP誘變時(shí)間對炭黑曲霉的致死率和正突變率的影響

2.3 炭黑曲霉突變株初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示,誘變后的陽性突變株顯色圈顯著大于初始菌株,說明ARTP誘變顯著提高了炭黑曲霉的產(chǎn)單寧酶能力。

a-誘變前；b-誘變后

如表1所示,以H/D值衡量菌株產(chǎn)單寧酶能力,挑選100株H/D值較大的菌株。初始菌株H/D值為1.356,誘變后最小值為1.405,最大值1.847。

表1 誘變后的陽性突變株顯色圈 (初篩結(jié)果)

續(xù)表1

菌株編號(hào)顯色圈直徑H/mm菌落直徑D/mmH/D菌株編號(hào)顯色圈直徑H/mm菌落直徑D/mmH/D2961.240.81.5008059.739.91.4963056.438.11.4808164.141.51.5453164.540.21.6048261.237.91.6153263.839.41.6198362.738.11.6463368.439.41.7368460.739.51.5373457.234.51.6588562.439.61.5763558.341.51.4058665.741.51.5833656.737.51.5128759.837.21.6083767.543.21.5638860.837.91.6043859.138.71.5278961.439.81.5433963.442.81.4819064.741.61.5554061.733.41.8479163.536.41.7454167.245.21.4879258.935.71.6504258.435.51.6459360.534.61.7494362.541.21.5179461.339.41.5564461.540.51.5199559.738.11.5674563.742.41.5029663.439.51.6054659.438.51.5439758.638.61.5184758.436.41.6049861.739.41.5664862.839.51.5909962.439.21.5924965.940.51.62710065.440.11.6315063.441.71.521

2.4 炭黑曲霉突變株的復(fù)篩

將初篩得到的100株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,復(fù)篩結(jié)果如圖4所示,篩選得到1株產(chǎn)單寧酶能力較高的突變株,酶活力為0.212 U/mL,與原始菌株酶活力0.135 U/mL相比提高了57%,遠(yuǎn)高于KUMAR等[20]所報(bào)道的0.062 5 U/mL。將得到的單寧酶高產(chǎn)菌株命名為NCUF M8。

圖4 100株炭黑曲霉突變株搖瓶發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

2.5 高產(chǎn)菌株的傳代穩(wěn)定性分析

如圖5所示,菌株經(jīng)過8次傳代并進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,單寧酶平均酶活力為 (0.208±0.002 5) U/mL。結(jié)果表明炭黑曲霉突變株NCUF M8具有較好的穩(wěn)定性,能高效生產(chǎn)單寧酶。

圖5 突變株NCUF M8的遺傳穩(wěn)定性

2.6 炭黑曲霉突變株發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.6.1 誘導(dǎo)物濃度對菌株產(chǎn)單寧酶的影響

如圖6所示,隨著誘導(dǎo)物單寧酸濃度的逐漸升高,菌株NCUF M8產(chǎn)單寧酶酶活力逐漸升高,在單寧酸質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)達(dá)到最高,為 (0.752±0.019) U/mL；當(dāng)單寧酸質(zhì)量濃度>60 g/L,酶活力有所降低,這可能是高濃度的單寧酸對微生物生長有著一定的抑制作用[21]。

圖6 誘導(dǎo)物濃度對突變株產(chǎn)單寧酶能力的影響

2.6.2 接種量對菌株產(chǎn)單寧酶的影響

如圖7所示,當(dāng)接種量為2%時(shí),發(fā)酵液中的單寧酶酶活力最高為(0.783±0.017 6) U/mL。在發(fā)酵產(chǎn)酶過程中,接種量過高,營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,積累的代謝物會(huì)影響細(xì)胞的生長,從而影響酶的產(chǎn)量[22]；接種量過低,細(xì)胞生長緩慢,從而延長了發(fā)酵周期,使產(chǎn)酶量偏低。

圖7 不同接種量對突變株產(chǎn)單寧酶能力的影響

2.6.3 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)單寧酶的影響

如圖8所示,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí),菌株產(chǎn)單寧酶能力最高,酶活力達(dá)(0.815±0.018) U/mL,此后酶活力趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)檫M(jìn)入發(fā)酵后期,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,微生物開始衰老,導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低[23]。發(fā)酵時(shí)間確定為4 d。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對突變株產(chǎn)單寧酶能力的影響

2.6.4 溶氧體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的影響

發(fā)酵液中的溶氧體積分?jǐn)?shù)對微生物的繁殖和代謝物形成有著重要的影響。炭黑曲霉為好氧微生物,發(fā)酵液的溶氧體積分?jǐn)?shù)直接影響其產(chǎn)單寧酶能力。如圖9所示,當(dāng)溶氧體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí),單寧酶酶活力最高達(dá)到 (0.882±0.011) U/mL,此后酶活力開始下降。

圖9 溶氧體積分?jǐn)?shù)對突變株產(chǎn)單寧酶能力的影響

2.6.5 誘導(dǎo)物添加時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的影響

如圖10所示,當(dāng)誘導(dǎo)物添加時(shí)間為24 h時(shí),對菌株產(chǎn)單寧酶能力影響不明顯；當(dāng)添加時(shí)間為36 h時(shí),菌株產(chǎn)酶能力最高,酶活力達(dá) (1.377±0.029) U/mL,此后添加誘導(dǎo)物菌株產(chǎn)酶能力顯著下降。這是由于炭黑曲霉突變株NCUF M8生長速度較快,在36 h時(shí)達(dá)到對數(shù)生長末期,此時(shí)添加誘導(dǎo)物有益于菌株生產(chǎn)單寧酶[24]。

圖10 單寧酸添加時(shí)間對突變株產(chǎn)單寧酶能力的影響

3 結(jié)果與討論

本研究利用ARTP誘變技術(shù)對炭黑曲霉FCYN212進(jìn)行誘變,結(jié)合溴酚藍(lán)顯色圈法的初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,選育出產(chǎn)單寧酶能力較高的突變株NCUF M8。突變菌株NCUF M8于28 ℃、180 r/min搖瓶發(fā)酵96 h,胞外酶活力達(dá)到0.212 U/mL,較原始菌株提高57%。經(jīng)過8次的傳代培養(yǎng),突變株產(chǎn)單寧酶能力穩(wěn)定。優(yōu)化后發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時(shí)間4 d、接種量2%、單寧酸質(zhì)量濃度60 g/L、溶氧體積分?jǐn)?shù)45%、誘導(dǎo)物添加時(shí)間36 h,此時(shí)胞外單寧酶酶活力達(dá)到最大,為1.377 U/mL,與優(yōu)化前相比發(fā)酵參數(shù)提高了549%。本研究通過誘變育種提高單寧酶酶活力,進(jìn)一步通過工藝優(yōu)化，將炭黑曲霉產(chǎn)酶能力提高了920%,為進(jìn)一步開發(fā)該菌株產(chǎn)單寧酶的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。