梅奇酵母轉化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇發酵條件優化

史榮超,劉灑灑,侯陽陽,張夢瑤,龔佳,江曉楠,楊曉兵

(西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)

2-苯乙醇(2-phenylethanol,2PE)是一種廣泛應用于食品、藥品和化妝品等領域的芳香醇,全球年產量約1萬t[1],也可用于調配草莓、焦糖、蜜香、奶油等類型的食用香精(GB 2760—2014)[2]。目前,天然提取和化學合成是生產2PE的主要方式。玫瑰、矮牽牛、番茄、茉莉等植物精油是天然原料[3-5],但易受地域和氣候的影響,2PE含量低,導致天然2PE價格昂貴(1 000 USD/kg)[1]。苯-環氧乙烷法和氧化苯乙烯加氫法是化學合成2PE主要方式,其反應條件苛刻,產品存在有毒殘留[6-7]。微生物合成具有低碳環保、不受地域和氣候影響、易于規模化生產等優勢,是天然提取和化學合成的有效替代策略。2PE微生物合成按底物不同分為從頭合成和非從頭合成。從頭合成途徑廣泛存在于微生物中,其底物為簡單碳源(如葡萄糖等),但路徑長、支路多,存在多種抑制作用,2PE產量較低[8]。非從頭合成(主要指艾氏途徑)的底物主要是L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe),因在微生物中轉化效率高而被廣泛開發利用[3]。

許多微生物具有合成2PE的能力,如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、梅奇酵母屬(Metschnikowiasp.)、肉桂內生菌屬(Sphingomonassp.)等[9-14]。美極梅奇酵母(Metsc-hnikowiapulcherrima)在高糖(>200 g/L)[15]、高酸(pH 3～4)條件下生長旺盛[16],能夠合成普切明酸[17]、2PE[16]等多種化合物,也可作為生物防控劑用于果蔬采收后的雜菌防控[18],同時也可在開放、非滅菌條件下生產微生物油脂[19]。M.pulcherrima利用天然葡萄汁僅可產生0.25 g/L的2PE[20]。對于Metschnikowiasp.轉化L-Phe合成2PE而言,已報道的轉化效率通常較低。CHANTASUBAN等[16]利用M.pulcherrimaNCYC 373在單水相發酵條件下合成的2PE為1.71 g/L(L-Phe 30 g/L),但摩爾得率僅0.08。CHREPTOWICZ等[21]利用梅奇酵母合成的2PE為2.3～2.71 g/L(L-Phe 5 g/L),摩爾得率為0.62～0.73。為提高2PE合成效率,本研究通過篩選高產2PE的梅奇酵母菌株,調整培養基組成及發酵條件(碳源、溫度和pH等)探究梅奇酵母在非滅菌(工業上滅菌通常伴隨著高能耗和高成本)、補充碳源條件下高效轉化L-Phe合成2PE。研究將為梅奇酵母高效轉化L-Phe合成2PE的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

美極梅奇酵母(M.pulcherrima)CICC 1467、桔梅奇酵母(M.citriensis)CICC 33213、梅奇酵母屬(Metschnikowiasp.)CICC 33020、美極梅奇酵母(M.pulcherrima)CICC 32343,中國工業微生物菌種保藏管理中心。所用菌株均采用YPD固體培養基劃線培養,培養條件為28 ℃,48 h。

1.1.2 培養基與主要試劑

固體YPD培養基(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂粉20,自然pH值,121 ℃滅菌20 min。

基礎轉化培養基：大量成分(g/L),葡萄糖26、L-Phe 20；微量成分(μg/L),維生素H2,泛酸鈣400,葉酸2,肌醇2000,煙酸400,對氨基苯甲酸200,鹽酸吡哆醇400,核黃素200,鹽酸硫胺素400,H3BO3500,CuSO440,KI 100,FeCl3200,MnSO4400,MoNa2O4200,ZnSO4400,KH2PO41 000,MgSO4500,NaCl 100,CaCl2100,pH 4.0。0.22 μm水系濾膜過濾。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,自然pH值,121 ℃滅菌20 min。

主要試劑：L-苯丙氨酸(純度98.5%)、2-苯乙醇標準品(純度99.0%)、棕櫚酸異丙酯(純度97.0%),上海麥克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF,純度≥99.5%),天津科密歐化學試劑有限公司；2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB,純度98.0%),上海易恩化學技術有限公司。

1.1.3 儀器與設備

ZQZY-85CS振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司；GC9790Ⅱ氣相色譜儀,浙江福立分析儀器股份有限公司；LC—2030 PLUS高效液相色譜儀,日本島津制作所；EVOLUTION 220紫外可見分光光度計,賽默飛世爾科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所；FE28 pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產2PE菌株的篩選

將CICC 1467、CICC 32343、CICC 33213、CICC 33020在YPD固體培養基上劃線培養,28 ℃活化30 h。挑取3個大小一致的單菌落,分別接種到含有50 mL基礎轉化培養基的250 mL搖瓶中,20 ℃,180 r/min條件下發酵,定時取樣。

1.2.2 培養基成分、pH和發酵溫度對2PE合成的影響

將CICC 1467在YPD固體培養基上劃線培養,28 ℃活化30 h,挑取3個大小一致的單菌落,分別接種到含有50 mL轉化培養基的250 mL搖瓶中,20 ℃,180 r/min條件下發酵120 h。探究因素和水平,按以下順序進行(無特殊說明,接種量均采用單菌落接種,溫度20 ℃,發酵時間120 h,pH 4.0)：

(1)L-Phe添加量(g/L)：0、4、8、12。

(2)碳源種類：葡萄糖、果糖、木糖、甘油(L-Phe 4 g/L)。

(3)葡萄糖添加量(g/L)：10、30、50、70、90、110(L-Phe 4 g/L)。

(4)初始pH：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(L-Phe 4 g/L,葡萄糖50 g/L)。

(5)發酵溫度(℃)：15、20、25、30(L-Phe 4 g/L,葡萄糖50 g/L,pH 3.0)。

1.2.3 接種量對2PE合成的影響

將CICC 1467在YPD固體培養基上劃線培養,28 ℃活化30 h。挑取1環單菌落至100 mL種子培養基中,28 ℃、180 r/min培養26 h(OD600約10)。5 000×g離心5 min分離出菌體,用無菌水洗滌2次,接種到轉化培養基。

將基礎轉化培養基的葡萄糖、L-Phe和初始pH分別改為50、4 g/L和3.0以作為新的轉化培養基。接種量分別為5%、10%、15%和20%(體積分數),25 ℃、180 r/min條件下發酵,定時取樣。

1.2.4 非除菌條件下發酵潛力的探究

轉化培養基同1.2.3。按5%接種量(體積分數)接種,25 ℃、180 r/min條件下發酵44 h。培養基處理共3種：對照組為蒸餾水配制后過濾除菌,處理一為蒸餾水配制不除菌,處理二為自來水配制后過濾除菌,處理三為自來水配制后不除菌。

1.2.5 檢測分析

采用氣相色譜法測定2PE產量,發酵液于8 000×g離心3 min,取上清液,用等體積棕櫚酸異丙酯振蕩1 min,8 000×g離心3 min,取上清液,用0.22 μm有機系濾膜過濾。氣相檢測條件：KB-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 mm)；進樣量0.5 μL；分流比：40∶1；進樣器220 ℃；程序升溫條件：190 ℃保持6 min；20 ℃/min升至240 ℃,保持2 min；檢測器250 ℃；載氣為氮氣,柱前壓：0.07 MPa；氣體流量：空氣300 mL/min、氫氣30 mL/min。

采用反相高效液相色譜法(HPLC)檢測L-Phe殘留量,分別取300 μL發酵液,150 μL 10 g/L DNFB溶液,150 μL 0.5 mol/L NaHCO3溶液(5 mol/L NaOH溶液調節pH至9.0)混合均勻,置于60 ℃水浴60 min(避光)[22]。用冰冷卻[23],恢復到室溫后,加入600 μL 0.01 mol/L KH2PO4溶液(5 mol/L KOH溶液調節pH至7.0),混合均勻后置于黑暗中15 min,0.22 μm濾膜過濾。色譜柱為Tnature C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),進樣體積10 μL,柱溫26 ℃,流速0.8 mL/min,檢測波長360 nm(紫外檢測器)；流動相配制：A相為0.05 mol/L NaAc溶液(pH=6.45±0.05),稱取4.1015 g無水NaAc,溶解于950 mL超純水中,用冰醋酸調節pH值至6.45,加10 mL DMF溶液,補水至1 L；B相為50%乙腈。洗脫程序如表1所示。

表1 利用反相高效液相色譜法檢測L-Phe的洗脫程序

葡萄糖測定：采用DNS法；菌體生物量：以OD600值表示;乙醇體積分數采用SBA-40D生物傳感分析儀測定;pH采用pH計測定。

2PE摩爾得率通過公式(1)計算：

(1)

式中：ρ1,2PE產量,g/L；M1,2PE相對分子質量；ρ2,L-Phe添加量,g/L；M2,L-Phe相對分子質量。

1.2.6 數據處理

采用SPSS 18.0對試驗數據進行差異性分析(ANOVA)檢查各個結果的顯著性差異,組間多重比較采用Duncan法,P<0.05,差異顯著。采用Origin 2018作圖。

2 結果和分析

2.1 高產2PE菌株的篩選

菌株的2PE合成能力決定了整個轉化過程的生產效率。為獲得高產2PE菌株,本研究對4株梅奇酵母合成2PE的能力進行了比較(圖1)。當培養基中以L-Phe為唯一氮源時,艾氏途徑才會占主要優勢[24],故本研究采用以L-Phe為唯一氮源的培養基進行發酵。結果表明,4株酵母的生長速率和2PE合成速率在前36 h均較慢,之后進入快速生長和產物快速合成階段,2PE合成與酵母生長呈正相關,4株酵母的2PE產量均在120 h達最大值,此時葡萄糖幾乎耗盡(小于2 g/L)。4株酵母中,CICC 1467合成2PE的能力最強,終產量達1.76 g/L,摩爾得率為0.12。CICC 33020、CICC 33213和CICC 32343的2PE最大產量分別為1.48、1.46和1.53 g/L,無顯著性差異(P>0.05)。因此,后續研究均采用CICC 1467進行。

a-生物量；b-葡萄糖消耗；c-2PE產量

2.2 L-Phe添加量對2PE產量的影響

L-Phe是通過艾氏途徑合成2PE的底物,添加適量的L-Phe可促進2PE的合成效率,提高底物利用率[25]。在初篩中,CICC 1467合成的2PE為1.76 g/L(L-Phe 20 g/L),摩爾得率僅為理論值的12%。故本研究比較了L-Phe添加量對2PE合成的影響,為構建2PE的高效轉化體系提供參考。研究發現,當L-Phe在0～12 g/L時,隨著L-Phe添加量的增加,生物量先增加后減少,2PE產量同樣先增加后減少(圖2)。L-Phe為4 g/L時,OD600達最大值19.45,相應2PE產量為1.60 g/L,摩爾得率達0.54。L-Phe大于4 g/L時,OD600無明顯差異(P>0.05),而葡萄糖消耗和副產物乙醇有所增加。L-Phe添加量為4、8和12 g/L的實驗組發酵結束后,L-Phe剩余量分別為1.28、5.09和8.86 g/L,利用率分別為68.0%、36.4%和26.2%。因此,L-Phe最適添加量為4 g/L。

圖2 L-Phe添加量對M.pulcherrima生長、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產量的影響

2.3 碳源對2PE產量的影響

艾氏途徑中苯乙醛到2PE的反應需要還原性輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)來提供電子供體[26],活細胞需要吸收能量來生成還原型輔酶以保持正常的氧化還原狀態,葡萄糖等碳源能保證還原性輔酶的再生[27]。本研究比較了木糖、甘油、葡萄糖和果糖(均為26 g/L)4種碳源對2PE產量的影響(圖3-a)。在相同質量濃度下,甘油能夠提供高于葡萄糖、果糖和木糖的還原力NADH[28],但結果表明4種碳源對CICC 1467合成2PE和生物量的促進效果依次為：葡萄糖=果糖>甘油>木糖。雖然甘油能夠提供更多的還原力NADH,但對于2PE合成的促進作用并不明顯,可能是CICC 1467胞內甘油代謝相關的酶活性不夠造成的。CICC 1467幾乎無法利用木糖,生物量和2PE分別僅有0.22和0.11 g/L。又因葡萄糖比果糖價格低,故后續研究均采用葡萄糖為碳源。當葡萄糖為10～110 g/L時,隨著添加量的增加,2PE產量先增加后不變(圖3-b),這與先前報道的結果(2PE產量先增加后減少)不一致[25],可能CICC 1467是耐高滲酵母,能夠在高糖環境下生長[15],而先前報道的K.marxianus不適合在高糖環境下生長[25]。當葡萄糖添加量為50 g/L時,2PE產量最高為1.85 g/L,摩爾得率為0.63。當葡萄糖添加量大于50 g/L時,2PE產量無顯著變化(P>0.05),而副產物乙醇產量增加。綜上,葡萄糖最適添加量為50 g/L。

a-碳源種類；b-葡萄糖添加量

2.4 初始pH對2PE產量的影響

培養基pH能夠顯著影響微生物生命活動,進而影響目標產物合成效率。其主要機理包括以下3方面：一是改變蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷,從而影響其生物活性；二是引起細胞膜電荷變化,改變微生物細胞吸收營養物質能力；三是改變環境中營養物質的可給性及有害物質的毒性[29]。故本研究探討了初始pH(2.0～6.0)對2PE產量的影響(圖4)。結果顯示,隨著初始pH的升高,生物量先升高后降低,2PE產量也隨之先升高后降低,但乙醇呈升高趨勢,表明較低pH有利于M.pulcherrima合成2PE,而不利于酒精發酵。但當初始pH為2.0時,菌體幾乎無法生長,OD600僅有0.08。當初始pH 3.0時,生物量和2PE產量最高,分別為18.35和2.20 g/L,2PE摩爾得率達0.74,乙醇體積分數僅有0.25%。

圖4 初始pH對M.pulcherrima生長、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產量的影響

當初始pH大于3.0時,生物量和2PE產量均降低,乙醇的體積分數升高,說明pH過高不利于CICC 1467的生長和2PE的合成,反而有利于乙醇發酵。綜上,最適初始pH為3.0。

2.5 發酵溫度對2PE產量的影響

溫度可通過改變細胞膜流動性來影響營養物質的攝入,進而影響細胞生長[30]。此外,胞內的絕大多數反應是在酶的催化下完成的,溫度也可通過影響酶活性來影響產物的合成。因此,本研究考察了CICC 1467在15～30 ℃下的2PE合成情況(圖5)。結果表明,CICC 1467在15 ℃下仍然能夠生長(OD600為12.04),并產生1.27 g/L的2PE,具有一定耐受低溫的能力。隨著溫度的升高,乙醇產量逐漸升高,25 ℃和30 ℃時達到最高(1%)。生物量和2PE產量先升高后下降,25 ℃時,生物量和2PE產量達到最高,分別為19.48和2.26 g/L,摩爾得率達0.76。因此,最適發酵溫度為25 ℃。

圖5 發酵溫度對M.pulcherrima生長、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產量的影響

2.6 接種量對2PE產量的影響

低接種量有利于提高2PE產量和得率,但接種量過低會延長發酵周期,增加生產成本；接種量過高雖然能夠縮短發酵時間,但會降低2PE產量和得率[31]。因此,接種量對合成2PE至關重要。本研究按照5%、10%、15%和20%的接種量(體積比,種子液OD600約為10)分別進行接種,考察其對2PE合成的影響(圖6)。結果表明,接種量越高,菌體增殖速率、糖消耗速率和乙醇合成速率越高。2PE合成速率與菌體增殖速率正相關(圖6-d),證明2PE合成與微生物生長相偶聯,這與CHANTASUBAN等[16]的研究相吻合。就乙醇合成而言,接種量在10%以上時,終產量無顯著差異(P>0.05),但均高于接種量為5%的發酵組(P<0.05)。當接種量為5%時,2PE產量在44 h達到最大值1.85 g/L,顯著高于其他發酵組(P<0.05)；而接種量為10%、15%和20%的發酵組合成的2PE最大產量分別為1.66、1.70和1.69 g/L,三者無顯著性差異(P>0.05)。因此,最佳的接種量為5%。

a-生物量；b-葡萄糖消耗；c-2PE產量；d-乙醇產量

2.7 非除菌條件下發酵潛力的探究

在工業生產上,培養基和發酵設備的滅菌過程會有較高的能耗成本和物料損失。美極梅奇酵母能夠產生普切明酸抑制微生物生長[17],SANTAMAURO等[19]已在未滅菌條件下成功合成微生物油脂。因此,本研究對CICC 1467在非除菌條件下的發酵潛力進行了探究,初始L-Phe、葡萄糖、pH、接種量分別采用：4 g/L、50 g/L、pH 3.0和5%。結果表明,培養基除菌與否對2PE產量、葡萄糖剩余量和乙醇產量均無顯著影響(P>0.05)(圖7)。

圖7 培養基處理方式對M.pulcherrima生長、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產量的影響

具體而言,以蒸餾水為溶劑制培養基時,除菌組2PE產量和得率為2.25 g/L、0.76,非除菌組則為2.27 g/L、0.77；用自來水配制培養基時,除菌組2PE產量和得率為2.28 g/L、0.77,非除菌組則2.24 g/L、0.76。本研究證明在搖瓶發酵水平上,自來水中可能存在的微生物對發酵過程不會造成影響,CICC 1467可以在非除菌條件下利用自來水配制的培養基高效合成2PE。

3 結論

微生物合成2PE是天然提取和化學合成的有效替代策略。當L-Phe 4 g/L、葡萄糖50 g/L、初始pH 3.0、發酵溫度25 ℃、接種量5%,用自來水配制培養基后,直接在非除菌條件下進行發酵,2PE摩爾得率達0.76,是目前利用美極梅奇酵母單水相生產2PE的最高水平。雖然本文中,美極梅奇酵母可在搖瓶中利用未除菌培養基高效轉化L-Phe合成2PE,但在更大體系中的轉化效果需要進一步驗證。此外,進一步提高2PE產量還需要解決其對微生物的細胞毒性問題。總之,本研究證明CICC 1467具備在非滅菌條件下高效轉化L-Phe合成2PE的能力,這對實際應用具有重要的參考價值。