多輪ARTP誘變快速篩選低產乙醛工業啤酒酵母

孫可澄,尹花,趙鑫銳,3,4,陳璐,李江華,3,4,侯曉平,堵國成,3,4,5*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室(青島啤酒股份有限公司),山東 青島,266000)3(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)4(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)5(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

啤酒是世界三大古酒之一,以其獨特的風味深受消費者的青睞[1]。啤酒中的風味物質對其口感和香氣起著極其重要的作用,而乙醛是嚴重影響啤酒風味及其穩定性的羰基化合物[2]。2～5 mg/L的乙醛使啤酒具有芳香的風味,若乙醛含量高于10 mg/L,不僅易產生腐爛青草味,還會縮短啤酒風味的保鮮期,甚至人體飲用后引起不良反應[3]。近年來,伴隨著酒精飲料工業的快速發展,質量安全成為不可忽視的議題。保持品牌特有風味的基礎上,如何降低啤酒中的乙醛含量,是生產企業普遍關注的焦點。

迄今為止,學者們相繼提出了啤酒中乙醛含量的控制措施[4]。然而,控制生產工藝不具有普遍適用性,構建酵母工程菌不符合食品安全規范,難以徹底解決啤酒風味問題。而啤酒中的乙醛主要來自于酵母的代謝,酵母內的乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶是代謝乙醛的關鍵酶,共同作用決定了乙醛的含量[5]。酵母從根本上決定了啤酒中乙醛的形成和積累,選育發酵性能優良的低產乙醛釀酒酵母也成為保持啤酒風味穩定、保障啤酒安全生產的有效途徑[6]。然而,前期篩選低產乙醛酵母菌株的研究中,普遍存在篩選周期較長[7]、工作量大[8]、成本高[8]和篩選效率偏低[9]的問題。因此,需要建立一套高效、快速的低產乙醛啤酒酵母菌株篩選策略。

從食品安全及啤酒實際生產的角度出發,結合目前乙醛含量控制方面存在的問題,本研究以Lager型啤酒工業酵母菌株為研究對象,采用多輪常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變育種手段對出發菌株進行改良,利用乙醇-雙硫侖抗性平板、高濃度乙醛篩選平板及其對應馴養液對誘變菌株進行平板篩選及液體馴化,形成誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系,同時以關鍵酶活性變化為低產乙醛復篩標準,通過實驗室搖瓶水平的啤酒模擬釀造體系,最終獲得發酵性能和生物學特性均與出發菌株無顯著差異的低產乙醛工業啤酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養基

Lager型啤酒工業酵母(出發菌株),江南大學生物工程學院生物系統與生物加工研究室保藏。

高濃度乙醛篩選培養基(g/L)：乙醛2,酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂粉20,121 ℃滅菌15 min(乙醛以0.45 μm有機濾膜除菌,待培養基滅菌冷卻后添加)。

高濃度乙醛馴養液(g/L)：乙醛3,酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,121 ℃滅菌15 min(乙醛添加方式同上)。

乙醇-雙硫侖篩選培養基(g/L)：乙醇10,雙硫侖(滅菌后添加)0.000 2,(NH4)2SO45,KH2PO41,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,酵母膏0.1,瓊脂粉20,115 ℃滅菌20 min。

乙醇-雙硫侖馴養液(g/L)：乙醇10,雙硫侖(滅菌后添加)0.002 0,(NH4)2SO45,KH2PO41,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,酵母膏0.1,115 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母浸出粉10，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑與原料

乙醛(99.5%，GC純度，CAS No. 75-07-0)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-庚酮(99.0%，GC純度，CAS No. 106-35-4)，上海麥克林生化科技有限公司；加拿大(卡普蘭德)皮爾森麥芽、卡斯卡特顆粒酒花(Cascade)、馬格努門顆粒酒花(Magnum)，均為進口市售。

1.2 儀器與設備

DLEUW22050麥芽粉碎機,Buhler-Miag公司；BGT-8A協定糖化儀,BIOER公司；B00 N-900 N超聲波細胞破碎儀,上海般諾生物科技有限公司；GC-2010AF氣相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 麥汁制備

45 ℃時,料水比1∶4(g∶mL)加水投料；升溫至48 ℃,保溫30 min；升溫至65 ℃,保溫40 min；升溫至72 ℃,保溫10 min；升溫至78 ℃,保溫10 min,糖化結束[10]。趁熱過濾,煮沸1 h,添加酒花(0.25‰)。調節麥汁至12°P。

1.3.2 ARTP誘變

將對數期的菌體離心洗滌3次,稀釋OD600為1.0。取10 μL菌懸液于無菌金屬載片(8 mm),以氦氣等離子束對酵母細胞進行誘變處理[11]。保持氦氣流速15.0 L/min,輸入功率100 W,處理距離2 mm,處理溫度<40 ℃。為了獲得最佳的誘變條件,設置處理時間為0、50、70、90、110和130 s,將金屬載片置于1 mL的無菌生理鹽水中,振蕩洗滌。將稀釋菌液涂布于YPD培養基,30 ℃培養48 h,致死率按公式(1)計算,繪制致死率曲線,并確定最佳照射時間。

(1)

1.3.3 高濃度乙醛及乙醇-雙硫侖平板篩選

將誘變菌液分別涂布于含有2.0 g/L乙醛和10 g/L乙醇、0.2 mg/L雙硫侖的抗性平板,30 ℃培養3～4 d后,挑取生長優勢菌株進行液體馴化[12-13]。

1.3.4 高濃度乙醛及乙醇-雙硫侖液體馴化

挑取2種抗性平板的生長優勢菌株,分別置于含有3.0 g/L乙醛和10 g/L乙醇、2.0 mg/L雙硫侖的液體培養基中,30 ℃培養2～3 d。

1.3.5 關鍵酶活力測定

1.3.5.1 粗酶液的制備

離心收集酵母細胞,用磷酸鹽緩沖液(pH 8.0,濃度0.05 mol/L)洗滌重懸,超聲破碎細胞(破4 s停5 s,共5 min),離心取上清液,4 ℃儲藏備用[14]。

1.3.5.2 酶活力測定

乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶均選用300 μL的酶活反應體系,分別以乙醇和乙醛為反應底物,添加細胞浸出液,采用單池時間掃描,連續5 min內,記錄340 nm波長處吸光度值[15]。340 nm下,吸光度值增加0.001為1個活力單位(U)。酶活性以總活力值表示(U/mg)。

1.3.6 啤酒發酵

菌株變溫擴培,靜置取酵泥,接種于麥汁(1×106CFU/mL)。扣上發酵栓,液封。12 ℃靜置培養8 d,糖度為4°Bx左右時,前酵結束。4 ℃靜置發酵7 d,發酵成熟,后酵結束。

1.3.7 乙醛等主要風味物質的測定

乙醛等啤酒中主要風味物質含量采用頂空氣相色譜儀進行測定,選取3-庚酮作為內標[16]。

1.3.8 發酵性能的測定

1.3.8.1 酒精度、原麥汁濃度的測定

依據GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》及GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》,檢測啤酒發酵液的酒精度和原麥汁濃度[17]。

1.3.8.2 發酵速度的測定

發酵過程中,定期記錄發酵液質量變化,以CO2損失質量比較菌株的發酵速度。菌株變溫擴培后置于150 mL麥汁中12 ℃發酵培養,定期搖瓶稱重,當失重量差值<0.2 g時,終止發酵[18]。繪制發酵醪質量損失與時間曲線,比較各菌株發酵速度的大小。

1.3.9 生物學特性的測定

1.3.9.1 生長性能的測定

活化菌株,以5%的接種量接于YPD培養基中,220 r/min,30 ℃培養。階段性取樣,波長600 nm處測定其吸光度值[19]。

1.3.9.2 絮凝性的測定

相繼以0.01 mol/L的EDTA-Na溶液和無菌水洗滌酵泥,棄去上清液,加入250 μL pH 4.5 HAc-NaAc緩沖溶液,立即在波長660 nm處測定OD1,室溫靜置30 min,取液面頂端50 μL,于波長660 nm處測定OD2。以pH 4.5的HAc-NaAc緩沖溶液為空白[20],絮凝性按公式(2)計算。

(2)

2 結果與分析

2.1 致死率曲線

為獲得最佳的誘變條件,對酵母菌液進行不同時間的誘變處理,致死情況見圖1。采用ARTP誘變育種時,若致死率偏低,則無法對釀酒酵母進行有效改良；若致死率偏高,易造成菌株性能的大幅改變,從而影響成品啤酒的主體風味。因此應保持菌株致死率80%～90%,即選擇最佳誘變時間為90 s。

圖1 不同誘變時間下的酵母致死率

2.2 初篩

2.2.1 高濃度乙醛平板篩選及液體馴化

吸取50 μL誘變菌液(1×103個/mL)涂布于乙醛質量濃度為2.0 g/L的抗性平板,30 ℃培養72 h。吸取1 mL無菌生理鹽水于平板表面,吹洗數次,直至洗去所有生長優勢菌株。稀釋菌液至OD600為5.0,按1%接種于含有3.0 g/L乙醛的液體培養基中馴化,30 ℃培養48 h,洗滌馴養菌株以進行下一輪誘變。

菌體誘變-平板篩選-液體馴養的流程重復3次,此過程中,不斷提高平板及馴養液中的乙醛濃度。一輪初篩平板共獲得136株突變菌株,二輪和三輪初篩平板分別獲得97、43株突變菌株。將第3輪馴養菌液涂布于高濃度乙醛篩選平板,獲得14株突變菌株。

2.2.2 乙醇-雙硫侖平板篩選及液體馴化

吸取50 μL誘變菌液(1×103個/mL)涂布于以乙醇為唯一碳源,雙硫侖質量濃度為0.2 mg/L的抗性平板,30 ℃培養96 h。吸取1 mL無菌生理鹽水于平板表面,吹洗數次,直至洗去所有生長優勢菌株。稀釋菌液至OD600為5.0,按1%接種于含有10 g/L乙醇、2.0 mg/L雙硫侖的液體培養基中馴化,30 ℃培養72 h。洗滌馴養菌株以進行下一輪誘變。

菌體誘變-平板篩選-液體馴養的流程重復3次,此過程中,不斷提高平板及馴養液中的雙硫侖濃度。最終,一輪初篩平板共獲得39株突變菌株,二輪和三輪初篩平板分別獲得27、9株突變菌株。將第3輪馴養菌液涂布于乙醇-雙硫侖篩選平板,獲得6株突變菌株。至此,共獲得20株初篩菌株。

表1 不同輪次篩選平板中的突變菌株數

2.3 復篩

啤酒發酵過程中,乙醇脫氫酶Ⅰ和乙醛脫氫酶分別促進乙醛轉化為乙醇和乙酸,而乙醇脫氫酶Ⅱ主要促進乙醇向乙醛的轉化[21]。因此,具有高乙醇脫氫酶Ⅰ、乙醛脫氫酶活性,低乙醇脫氫酶Ⅱ活性是篩選低產乙醛菌株的關鍵[22]。為此,對初篩所得的20株酵母進行關鍵酶活的測定。

表2 不同輪次馴養液的菌液吸光值

以關鍵酶活性變化率為篩選指標,由表3可知,初篩菌株的多種關鍵酶活性正突變率均達70%以上。其中乙醇脫氫酶Ⅰ活性增幅高于50%以上的有3株,分別為Lager-13、Lager-16和Lager-14；乙醇脫氫酶Ⅱ活性降幅高于50%以上的有6株,分別為Lager-1、Lager-12、Lager-5、Lager-16、Lager-19和Lager-13；各菌株乙醛脫氫酶活性增幅普遍不高,僅有Lager-2、Lager-9和Lager-16的增幅高于15%。綜合3種關鍵酶活性變化率,以三者總和為篩選指標,在20株初篩菌株中,選擇Lager-12、Lager-13和Lager-16作為復篩菌株。

表3 初篩菌株關鍵酶活性及變化率

2.4 發酵驗證

2.4.1 乙醛等主要風味物質的測定

乙醛作為啤酒中含量最高的揮發性羰基化合物,直接影響了啤酒風味的協調和穩定性。由表4可知,突變菌株的啤酒發酵液中乙醛含量均顯著低于出發菌株。其中,Lager-16和Lager-13的乙醛含量降幅較大,分別為61.63%和61.14%；Lager-12的乙醛含量降幅為55.95%。

表4 出發及突變菌株發酵結束時酒樣中的主要風味物質含量 單位：mg/L

篩選低產乙醛工業啤酒酵母,不僅要精確監測發酵液中的乙醛含量,也需考察其余主要的風味物質,以滿足實際生產的需求。除乙醛含量以外,相對出發菌株,Lager-12和Lager-13發酵結束時風味物質中的總醇、總酯含量均出現10%～15%的下降,與出發菌株的整體風味存在一定差異；而Lager-16發酵結束時總醇、總酯含量雖略有增加,但增幅低于6%,與出發菌株在整體風味上無明顯差異。

2.4.2 發酵性能的測定

2.4.2.1 酒精度、原麥汁濃度的測定

酒精度、原麥汁濃度是評價啤酒風味和質量的重要指標。酒精度越高,麥汁利用率越高,酒體口感越醇厚[23]。取適量后酵結束的酒樣,測定結果如圖2-a所示。突變菌株相較出發菌株的酒精度和原麥汁濃度均偏高,其中Lager-13和Lager-16的酒精度增幅更明顯,分別為14.29%和8.57%。此現象與復篩結果一致,突變菌株中的乙醇脫氫酶Ⅰ活性增加、乙醇脫氫酶Ⅱ活性降低,直接導致乙醇積累量升高。

2.4.2.2 發酵速度實驗

啤酒酵母的發酵速度與菌種有直接的關系。通常酵母的發酵速度越快,發酵周期越短,啤酒的風味更清爽、品質更穩定[24]。由圖2-b可知,發酵前2 d,各菌株的發酵速度逐步提升；2 d后,降糖速度迅速減慢,發酵逐步停止。發酵前4 d,各突變菌株的發酵速度較高；5 d后,出發菌株的發酵速度較高。縱觀發酵過程,出發菌株與各突變菌株的發酵時長一致,發酵速度無明顯差異。

a-酒精度及原麥汁濃度；b-發酵速度

2.4.3 生物學特性的測定

2.4.3.1 生長性能實驗

將Lager、Lager-12、Lager-13及Lager-16分別接種于YPD培養基中,于30 ℃,220 r/min條件下培養。發酵前期間隔3 h取樣,后期間隔2 h取樣,檢測其在波長600 nm處的吸光度,結果如圖3-a所示。發酵前期各菌株生長性能基本一致,對數中后期各突變菌生長性能較出發菌均有所降低,但彼此間差異不大(≤7.14%)。

2.4.3.2 絮凝性實驗

酵母絮凝性在啤酒生產上具有重要意義,其差異會直接影響發酵階段酵母的回收再利用,進而改變啤酒的風味[22]。因此,對出發菌株及3株突變菌株的絮凝性進行測定。如圖3-b所示,突變菌株經多輪誘變、馴養,絮凝性較出發菌株均有小幅提升(≤1.99%),彼此間差異不大。

a-生長曲線；b-絮凝性

2.4.4 發酵驗證結果

為考察突變株是否具有低產乙醛特性及良好的釀造性能,經啤酒發酵模擬實驗,對比了突變菌與出發菌的主要酒體風味、發酵性能和生物學特性。結果表明,3株突變株均表現出良好的低產乙醛性能,其中Lager-16啤酒發酵液中的乙醛含量最低。同時,Lager-16與原始菌株啤酒發酵液中主體風味物質差異更小,酒精度和原麥汁濃度有所提升；發酵速度更快,生長曲線與原始菌株趨勢大致相同,絮凝性略有升高(1.30%)。

綜上,突變株Lager-16的低產乙醛性能突出,且與出發菌株Lager的主要酒體風味、發酵性能及生物學特性指標存在小范圍內的上下波動,無明顯差異。因此,選擇突變菌株Lager-16作為低產乙醛啤酒工業酵母。

3 結論與討論

以Lager型啤酒工業酵母菌株為研究對象,采用多輪ARTP誘變育種手段對出發菌株進行改良,利用乙醇-雙硫侖抗性平板及高濃度乙醛篩選平板及其馴養液對誘變菌株進行定向篩選及馴化,形成誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系,共獲得初篩菌株20株；同時以乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶等關鍵酶活性變化為低產乙醛釀酒酵母的復篩標準,酶活性正突變率均達70%以上,優選酶活性變化顯著的復篩菌株3株；通過實驗室搖瓶水平的啤酒模擬釀造體系,驗證突變菌株及原始菌株的主要酒體風味、發酵性能和生物學特性是否存在顯著差異,最終選擇突變菌株Lager-16作為低產乙醛啤酒工業酵母。

通過誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系、關鍵酶活性變化復篩實驗和啤酒發酵驗證(圖4),篩選得到的突變菌株Lager-16發酵成品啤酒中乙醛含量由出發菌株的42.03 mg/L降低至16.51 mg/L,降幅為61.63%。綜合菌株生物學特性及各項發酵性能指標,突變株Lager-16滿足啤酒釀造要求,具有工業應用前景。

圖4 篩選策略流程圖