青稞結構對淀粉體外消化的影響

張翼麟,謝勇,易川虎,劉雄,*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715) 2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學),重慶,400715)3(昌都君親農業科技開發有限公司,西藏 昌都,854000)

代謝綜合征是一組代謝紊亂癥候群,包括高血糖、肥胖、II型糖尿病等。近年來,全球肥胖人數呈指數級增長,代謝綜合征也在全球范圍內越來越流行[1-2],通過調節飲食來預防相關疾病已經逐漸成為一種重要的方法。全谷物(whole grain,WG)食物能通過其中各種生物活性成分的協同作用[3],如膳食纖維、抗性淀粉、多酚、植物甾醇、維生素和礦物質等,降低餐后血糖反應[4]、調節腸道菌群[2],從而起到調節血糖[5]、預防肥胖[6]和II型糖尿病[7]等作用。

青稞(HordeumvulgareL.)又稱裸大麥,是青藏高原地區的主要農作物之一。青稞富含膳食纖維,特別是其中的β-葡聚糖(beta-glucan,BG)含量在3.66%～8.62%,是世界上β-葡聚糖含量最高的谷類作物[8]。大量研究表明,β-葡聚糖能通過增加消化體系黏度[9]以及降低α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶酶活性[10]等方式抑制淀粉的消化,從而降低餐后血糖濃度,實現降血糖功效。也有研究表明,食物的結構特征在淀粉消化和血糖反應中也起著重要的作用,破壞食物結構的完整性可能會增加淀粉消化速率[11]、降低其各項生理功效[12]。然而,β-葡聚糖特性和全谷物結構在調節血糖生理活性中誰占主導作用尚不清楚。因此,本文通過分析青稞全粉中β-葡聚糖對淀粉消化的影響,并探究其體外降血糖功效潛在機理,為青稞的加工提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞全粉(hull-less barley,HB),將青稞粉碎過100目篩；高峰α-淀粉酶、α-淀粉酶、胰酶、胃蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、異硫氰酸熒光素、熒光增白劑,美國Sigma公司；交聯β-葡聚糖含量試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設備

HH-6D數顯恒溫水浴磁力攪拌鍋,惠州市宏業儀器有限公司；AXTG16G臺式高速離心機,鹽城市安信實驗儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀,英國Malvern公司；TCW-3快速黏度糊化儀,澳大利亞 Newport Science Corp 公司；Phenom Pro-17A00403掃描電鏡,荷蘭Phenom World公司；LSM780激光共聚焦顯微鏡,德國Zeiss公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞全粉體外消化

將樣品分為5組,試驗設計如表1所示。為探究β-葡聚糖在青稞全粉中對淀粉體外消化影響的機理,以去掉纖維素的實驗組作為對比。加入酶后于50 ℃水浴中反應30 min,經離心去上清液并補入4 mL緩沖液后,用0.2 mL 2 mol/L HCl溶液調pH至1.2,沸水浴5 min糊化,冷卻至室溫。體外模擬消化在MINEKUS等[13]的方法基礎上加以修改。加入3 mL模擬人工胃液,30 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液,1 mL 29.5 mg/mL胃蛋白酶,于37 ℃消化30 min,隨后加入0.5 mL 1 mol/L NaHCO3溶液終止反應并調pH至6.8；加入3 mL模擬人工腸液,80 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液,1 mL 12.4 mg/mL胰蛋白酶,于37 ℃消化120 min。消化全過程使用轉子勻速攪拌,第5組在胃消化時用滅活的胃蛋白酶液代替胃蛋白酶液。

表1 青稞全粉體外消化及影響因素分析

在模擬腸消化階段的30、60、90、120 min時各取0.1 mL清液,沸水浴滅酶,用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase-peroxidase,GOPOD)試劑測定葡萄糖含量,結果用葡萄糖生成量表示,如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔA,樣品吸光度-空白吸光度；VF,終體積,mL；ΔA標,100 μg葡萄糖標品吸光度-空白吸光度。

1.3.2 青稞淀粉體外水解

青稞β-葡聚糖、淀粉和蛋白質的提取分別參照KUREK等[14]、CAO等[15]和楊希娟等[16]的方法。

取5根離心管,分別加入0、15、35 mg青稞β-葡聚糖和15、35 mg青稞蛋白,再于每支心管中加入100 mg青稞淀粉；加入4 mL模擬胰液,沸水浴糊化10 min,冷卻至室溫后再加入1 mL 10 mg/mL α-淀粉酶,于37 ℃下水解,在反應10、30、60、90 min分別取0.1 mL清液,用GOPOD試劑測定葡萄糖含量,結果用淀粉水解率表示：

(2)

式中：ΔA,樣品吸光度-空白吸光度；VF,終體積,mL；ΔA標,100 μg葡萄糖標品吸光度-空白吸光度；0.9,葡萄糖轉換為淀粉的轉換系數；m,樣品質量,mg。

1.3.3 青稞β-葡聚糖的含量

將樣品分為青稞全粉組、全粉去除蛋白組和全粉去除淀粉及蛋白組,各組稱取100 mg 青稞于離心管,實驗組再通過預處理除去蛋白或淀粉：加入1 mL 1 mg/mL高峰α-淀粉酶,調pH至7.0,于90 ℃下反應15 min；加入1 mL 1 mg/mL胃蛋白酶,調pH至4.0,于40 ℃下反應15 min。酶解處理完成后,加入7 mL 體積分數95%的乙醇,沸水浴5 min,加入轉子攪拌,4 000 r/min離心10 min,棄上清液,再加入7 mL 95%乙醇離心,重復3次即完成預處理。β-葡聚糖的測定方法參照Megazyme公司交聯β-葡聚糖試劑盒說明書。

1.3.4 青稞的微觀結構

將青稞顆粒浸泡于水中12 h,用薄刀片將其切成厚度為5 μm的薄片,凍干備用。染色參考LANGENAEKE等[17]的方法并加以修改,用質量分數0.25%的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和質量分數0.01%的熒光增白劑(calcofluor white M2R,CWM2R)分別染色10 min,并用蒸餾水清洗3次,完成后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。另外,用掃描電鏡觀察凍干切片和過篩后青稞粉的微觀結構。

1.3.5 青稞全粉粒徑測定

將樣品分為青稞全粉組、全粉去β-葡聚糖組和全粉去蛋白組,各稱取500 mg HB,用30 mL去離子水稀釋。去β-葡聚糖組、去蛋白組分別添加30 mg β-葡聚糖酶、胃蛋白酶,于室溫下酶解1 h。用激光粒度儀Mastersizer 2000測定其粒徑分布,參數設置為：分散劑為水,樣品折射率1.520,遮光度為(12±1)%。結果中平均粒徑用體積平均徑D[4,3]表征。

1.3.6 青稞全粉及淀粉糊化特性分析

糊化特性用快速黏度分析儀測定,根據文獻[18]并稍做修改。將樣品分為青稞全粉組、全粉去β-葡聚糖組、全粉去蛋白組、青稞淀粉組、青稞淀粉加β-葡聚糖組、青稞淀粉加蛋白組。青稞全粉的3組各稱4.0 g青稞全粉,青稞淀粉的3組各稱3.0 g青稞淀粉于樣品鋁盒,再加入一定量的水,添加量由儀器系統計算,并攪拌均勻。在160 r/min攪拌下測定糊化特性,測定程序如下：在50 ℃下加熱1 min,4.5 min內均勻升溫到95 ℃,在95 ℃下加熱2 min,隨后又在4.5 min內均勻降溫至50 ℃,在50 ℃保持2 min。記錄結果中樣品的峰值黏度、谷值黏度、終值黏度、回生值、糊化溫度。

1.4 數據分析

使用Excel 2010軟件、SPSS 21.0軟件及Origin 2018軟件進行數據分析和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 青稞全粉的體外消化

如圖1所示,相比于未處理的青稞全粉,除去纖維素和β-葡聚糖都能提高淀粉的消化率。在60 min之前,除去纖維素比除去β-葡聚糖的促消化作用更強,而60 min之后,除去β-葡聚糖的青稞粉中淀粉消化速率呈現急劇上升的趨勢。由此可知,在青稞全粉內,淀粉的消化前期主要受纖維素的影響,后期則受β-葡聚糖影響更大。這可能是因為水解掉纖維素后,細胞壁結構受到較大程度的破壞,增加了淀粉與酶的接觸面積[19],從而加快了淀粉的消化。而細胞壁中網狀β-葡聚糖結構的包裹作用仍然存在,所以淀粉的釋放速度較為均勻；而β-葡聚糖雖然參與構成了細胞壁結構,但其可能不占主導地位,故水解β-葡聚糖對細胞壁的破壞程度不如纖維素,淀粉仍被較完整的細胞壁所包裹,所以消化前期淀粉只能緩慢地釋放,與細胞壁周圍的酶作用,但隨著消化的進行,細胞壁中由纖維素維系的結構逐漸被破壞,到達一定程度后,周圍的酶得以進入細胞[20]與大量堆積在細胞內且脫離了β-葡聚糖包裹的游離淀粉作用,所以消化速度顯著提升。

圖1 青稞全粉中纖維素、β-葡聚糖及蛋白質對淀粉體外消化的影響

另外,未經胃消化的青稞粉保留了更多的蛋白質,淀粉的消化率顯著低于正常消化的全粉,說明在青稞全粉中蛋白質也會對淀粉消化有抑制作用。部分蛋白質也參與了細胞壁的構成,酶解蛋白質后完整的細胞結構也會受到一定的破壞。除此之外,還有一種可能的解釋是在青稞全粉中蛋白質與淀粉之間存在相互作用力,對淀粉的釋放和酶解產生影響,而正常消化的全粉中的蛋白質被胃蛋白酶酶解,這種相互作用力被破壞,因此淀粉的消化率更高。KIM等[21]和JEKINS等[22]發現了小麥粉中存在蛋白質-淀粉相互作用,這種作用具有抑制小麥制品中淀粉消化的能力,LI等[23]最近也進一步證實了小麥粉中蛋白質含量的增加能夠提高淀粉對α-淀粉酶的抵抗力。在青稞全粉中,這種蛋白質-淀粉相互作用力可能也同樣存在,且影響著淀粉的消化。

2.2 青稞β-葡聚糖和蛋白質對淀粉體外水解的影響

如圖2所示,將純的青稞β-葡聚糖和蛋白質加入青稞淀粉后,均能起到一定程度促進淀粉體外水解的作用,且隨添加量增加促進作用更加明顯,這與2.1中青稞全粉內β-葡聚糖和蛋白質會抑制淀粉消化的結論截然相反。說明β-葡聚糖和蛋白質對淀粉的抑制作用不是通過抑制酶活性實現的,而可能是因為外加β-葡聚糖和蛋白質后并不能形成完整的青稞細胞結構,沒有細胞壁包裹以及其他作用力束縛的淀粉直接暴露在淀粉酶的作用下,仍易被水解。因此,β-葡聚糖和蛋白質之所以能減緩青稞淀粉消化并不是因為其本身具有抑制作用,而可能是得益于青稞的完整結構。

圖2 青稞β-葡聚糖、蛋白質對青稞淀粉水解的影響

2.3 青稞淀粉和蛋白質對β-葡聚糖含量的影響

如圖3所示,去除淀粉和蛋白質后的青稞粉中測得的β-葡聚糖含量最高,為(6.09±0.10)%；只去除蛋白質的青稞粉中β-葡聚糖含量次之,為(5.82±0.08)%；而未處理的青稞全粉中β-葡聚糖含量僅為(5.60±0.06)%。這說明在青稞全粉內,淀粉和蛋白質的存在會降低β-葡聚糖的測定含量。一種可能的解釋是在青稞完整結構中β-葡聚糖、淀粉、蛋白質形成了某種特殊結構,三者間產生了一定的相互作用力,這種結構使β-葡聚糖被部分包裹,降低了β-葡聚糖被酶水解的效率,從而降低了β-葡聚糖含量的測量值。而通過高峰α-淀粉酶和胃蛋白酶的作用后,這些結合的淀粉和蛋白質被水解,更多的β-葡聚糖得以釋放[24],進而被酶水解,因此BG含量的測量值增加。

圖3 青稞全粉中淀粉和蛋白質對β-葡聚糖含量測定的影響

2.4 青稞β-葡聚糖和蛋白質對青稞全粉粒徑大小及分布的影響

如圖5所示,青稞全粉的粒徑分布在1～10、10～100 和100～1 000 μm的粒徑區間內各存在1個峰。相較于青稞全粉,去掉BG或蛋白質后的粒徑變化呈現了相似的趨勢,即位于100～1 000 μm區間的峰高降低,10～100 μm和1～10 μm區間的峰高提高,且平均粒徑降低：青稞全粉為(118.61±8.05) μm,去除蛋白質后降低至(92.38±1.93) μm,去除BG后降低為(48.26±1.45) μm。由此可見,BG對全粉粒徑的影響更大,這可能是因為BG主要分布于細胞壁中,水解β-葡聚糖后細胞完整性受到一定程度的破壞,且BG形成的網狀結構的包裹作用消失,細胞內的小顆粒物質如淀粉溶出,進而影響了測得的粒徑大小及分布。而相比于β-葡聚糖,蛋白質對細胞結構的作用要弱,主要組成細胞膜,在機械粉碎作用下容易破裂,僅有少數鑲嵌于細胞壁[12],故水解蛋白質對顆粒粒徑的影響相對較小。這一結果與CHEN等[20]比較完整蕎麥粉和經過破碎的蕎麥粉得出的結論一致。

a-青稞原料；b-青稞片放大1 000倍的圖像；c-青稞粉放大1 000倍的圖像；d-青稞片在激光共聚焦顯微鏡下的圖像,放大倍數10倍

2.5 青稞全粉及淀粉糊化特性分析

對比未處理的青稞全粉,去掉β-葡聚糖或蛋白質后的青稞粉以及單獨的青稞淀粉糊化黏度都顯著降低。更高的終值黏度表明直鏈淀粉分子之間的結合強度在未處理的青稞全粉中最大[25],因此β-葡聚糖和蛋白質在青稞全粉內都會影響淀粉的糊化特性,這和LIU等[26]的研究一致,他們發現相較于蛋白質,β-葡聚糖對淀粉糊化特性的影響更大,這可能是因為β-葡聚糖在細胞壁中形成的網狀結構將附近的蛋白質和淀粉包裹在一起形成了牢固的結構,共同影響青稞全粉的糊化黏度[27]。與在青稞全粉中相反,單獨的純青稞BG或蛋白質加入青稞淀粉中反而會降低糊化過程中體系的黏度,PEREZ-QUIRCE等[28]也發現向面包中添加小分子質量和中分子質量的β-葡聚糖能降低糊化過程體系的黏度,且隨著添加量增加作用越明顯,這可能是因為β-葡聚糖和蛋白質的加入減少了糊狀混合物中可利用的水分,進而限制了淀粉顆粒的吸水膨脹,提高完整顆粒的保留率,降低了糊化黏度[29],而在青稞全粉中,完整的青稞結構對體系糊化黏度的增加作用強于這種降低糊化黏度的作用,水解β-葡聚糖和蛋白質會破壞青稞結構的完整性,故糊化黏度有所降低。這也解釋了為什么β-葡聚糖和蛋白質在青稞全粉內能抑制淀粉消化,而單獨和青稞淀粉混勻又會促進淀粉水解。

表2 青稞β-葡聚糖和蛋白質對青稞全粉和青稞淀粉糊化特性的影響

2.6 青稞顆粒的微觀結構

掃描電鏡下觀察青稞顆粒切片,發現青稞淀粉主要分布于細胞內部(圖4-b),而多數淀粉在青稞顆粒研磨粉碎的過程中由于細胞結構破壞而游離出來 (圖4-c)[30],只有部分仍保持完整的細胞結構。激光共聚焦顯微鏡下觀察到被染成藍色的青稞β-葡聚糖呈網狀分布于細胞外層的細胞壁中(圖4-d),這種分布與ZHANG等[27]觀察到的一致,他們發現β-葡聚糖在細胞壁中形成了網狀結構,這種網狀結構能進一步將附近的蛋白質和淀粉包裹在一起形成緊密的結構,從而降低淀粉酶的可及性,抑制淀粉的消化。這種結構不僅能解釋淀粉和蛋白質影響β-葡聚糖含量測定這一現象,同理也說明了青稞全粉中β-葡聚糖和蛋白質抑制淀粉消化的原因。

圖4 青稞β-葡聚糖和蛋白質對青稞全粉粒徑分布的影響

3 結論

研究表明,青稞β-葡聚糖主要位于青稞細胞壁,并對青稞淀粉起到包裹的作用,從而影響了青稞全粉的粒徑及糊化特性,且全粉中的β-葡聚糖、蛋白質及纖維素對青稞淀粉的體外消化有抑制作用,而將青稞β-葡聚糖、蛋白質及淀粉重組后,這種作用即消失,且黏度也降低,同時,去除青稞蛋白質和淀粉增加了青稞β-葡聚糖的含量,這些結果說明青稞β-葡聚糖及蛋白質均能抑制淀粉的消化,且這種作用主要得益于青稞的完整細胞結構而不是黏度。因此,青稞全粉的完整結構在抑制淀粉消化中其主導作用,青稞全粉及相關產品更有利于人體健康,特別是對于肥胖和糖尿病患者。但由于體外消化和體內研究有諸多差異性,關于青稞的降血糖功效仍需進一步深入研究。