葡聚糖分子質量對其與牛血清白蛋白共聚物性質的影響

張曉燕,孟令莉,吳子健*,劉丹丹,趙穎濤

1(天津商業大學 生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津,300134) 2(天津商業大學 藝術學院,天津,300134)

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)是一種血漿蛋白,具有維持滲透壓、可作為載體等作用[1]。特別是其傳遞營養物質的作用,近年來受到廣泛關注。但受到其自身結構性能(如乳化性、乳化穩定性、起泡性等)的影響,由其制備成的載體不穩定,易發生相分離[2]。而研究改性的BSA,對于改善其功能性質,開發新的應用途徑有著非常重要的意義。

目前,研究發現美拉德反應能夠改善蛋白質的功能特性,且由多糖-蛋白形成的共聚物制備的乳濁液穩定性良好[3]。美拉德反應是糖分子中還原末端羰基與蛋白質分子中的氨基酸殘基側鏈上的ε-氨基進行的接枝反應,是一種綠色、安全、無污染的蛋白質改性方法[4]。通過美拉德反應接枝多糖后的蛋白質在pH穩定性、乳化性、起泡性和熱穩定性等方面都有明顯改善[5-7]。改性后的蛋白質不僅可以應用于食品的功能成分、添加劑,還可以對不穩定的生物活性進行包埋和運輸[8-9]。MENGIBAR等[10]發現乳球蛋白-殼聚糖美拉德共聚物可提高乳液體系的氧化穩定性和物理穩定性；YANG等[11]研究表明大豆蛋白-多糖共聚物可提高整個乳液體系的儲存穩定性；CHENG等[12]研究得出葡聚糖(dextran,DEX)的接枝可提高大米蛋白的乳化性與乳化穩定性；WANG等[13]的研究表明BSA-DEX共聚物包埋姜黃素可改善其儲藏穩定性及抗氧化活性。由此可見,接枝反應改性的蛋白已經在食品中的揮發性成分(包括精油)、辛香料及生物活性物質的包埋中發揮舉足輕重的作用[14]。但是,DEX的分子質量對于接枝產物的性質也會產生影響。

目前,對于多糖分子質量是否會影響其共聚物的理化性質及穩定性鮮有報道,這就使得改性糖蛋白的應用受到環境、條件和應用領域的制約。本研究通過BSA-DEX共聚物中蛋白質分子質量、結構，乳化性及乳化穩定性、起泡及泡沫穩定性等方面的測定,分析DEX分子質量對BSA-DEX共聚物理化性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白Ⅴ(分子質量68 kDa),Solarbio公司；4種葡聚糖(分子質量分別為1 k、5 k、70 k、100 kDa),MACKLIN公司；三羥甲基氨基甲烷,中奧天元公司；考馬斯亮藍R-250,Beyotime公司；1-苯胺基-8苯磺酸(1-anilino-8-napthalene sulfonic acid,ANS),Sigma Aldrich公司；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、SDS,其他試劑均為國產分析純。

FD-5N型真空冷凍干燥機,日本EYELA公司；紫外可見分光光度計、Seven Excellence pH計,瑞士METTLER公司；T10basic ULTRA-TURRAX小型分散機,德國IKA公司；SE 260型垂直電泳系統,美國Hoefer公司；NanoPhotometer-N50型超微量紫外分光光度計,德國IMPLEN公司；Essential V6型凝膠成像系統,英國uvitec公司；FL970熒光分光光度計,香港Techcomp公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BSA-DEX共聚物的制備

參考TU等[15]的方法并做調整：將DEX與BSA以1∶1的質量比溶解在PBS中(0.01 mol/L,pH 7.0),調節蛋白溶液的最終質量濃度為10.00 mg/mL,室溫下攪拌至完全溶解,凍干,凍干的樣品密封后置于溫度60 ℃,濕度79%的密閉環境中反應24 h。設置參數為:對照組BSA為未添加DEX；BSA與分子質量分別為1 k、5 k、70 k、100 kDa的DEX所得共聚物分別命名為BDC 1、BDC 5、BDC 70和BDC 100。

1.2.2 SDS-PAGE

參照FAN等[16]的方法。分離膠10%、濃縮膠4%、蛋白質質量濃度5 mg/mL,上樣量7.0 μL,電壓200 V、電泳時間50 min左右。

1.2.3 傅里葉紅外光譜

傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)參照 ZHAO 等[17]的方法。稱取適量樣品[m(樣品)∶m(溴化鉀)=1∶100],研磨成均勻的粉末并壓成薄片,用傅里葉變換紅外譜儀作全波段(4 000～400 cm-1)掃描,掃描16次,掃描前用溴化鉀薄片扣除背景。

1.2.4 接枝度的測定

參考FENG等[18]的方法。準確稱取40.00 mg的OPA,溶解在1.0 mL的甲醇中,然后依次加入2.5 mL的SDS(20%,質量分數),25 mL的四硼酸鈉(0.1 mol/L),100 μL的β-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容至50 mL。測定樣品時,取4.0 mL的OPA溶液,加200 μL的樣品混合均勻,置于35 ℃的水浴中反應2 min,在波長340 nm下測吸光度值A。空白對照加入200 μL蒸餾水代替樣品。按照上述方法用賴氨酸代替樣品繪制賴氨酸標準曲線。根據該曲線,計算樣品中游離氨基的含量,并根據公式(1)測定樣品的接枝度：

(1)

式中:c0,接枝反應前溶液中自由氨基的濃度,mol/L；c1,接枝反應后溶液中自由氨基的濃度,mol/L。

1.2.5 表面疏水性的測定

參考XUE等[19]的方法,20.0 μL ANS溶液(8 mmol/L)和5.0 mL不同質量濃度蛋白溶液(0.01～0.05 mg/mL)均勻混合,在室溫下反應1.0 min后,測定其熒光強度。測定條件：激發波長(EX)和發射波長(EM)分別為280和490 nm,以上述不同濃度的蛋白溶液(0.01～0.05 mg/mL)為空白。以蛋白質質量濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標作圖,直線斜率即是蛋白質表面疏水性指數。

1.2.6 熒光光譜的測定

按照YAN等[20]的方法測定樣品的內源性熒光。調節蛋白終質量濃度為0.02 mg/mL,激發波長280 nm,掃描波段310～450 nm,狹縫寬度5 nm,掃描速率2 400 nm/min。

1.2.7 美拉德反應褐變程度的測定

褐變程度的測定參照DJELLOULI等[21]的方法。調節蛋白質量濃度為5.00 mg/mL,以不加蛋白樣品的PBS為空白樣,在420 nm下測定吸光度值,即表示共聚物蛋白的褐變程度。

1.2.8 色差的測定

采用SANMARTIN等[22]的方法,稍作調整。采用色差儀對樣品的色澤進行測定,顏色參數L*、a*、b*值分別表示亮度值、黃綠值和紅藍值。

1.2.9 乳化性及乳化穩定性的測定

蛋白的乳化活性(emulsion activity index,EAI)和乳化穩定性(emulsion stability index,ESI)的測定分別參照崔珊珊[23]和CHEN[24]的方法測定。配制蛋白溶液至終質量濃度為1.0 mg/mL,并以體積比3∶1加入玉米胚油,用均質頭均質(轉速16 000 r/min)1 min后,立即從底部抽取100 μL溶液,并加入5.0 mL SDS溶液(0.1%、pH 7.0),混合后再混合均勻,測定500 nm波長下的吸光度記為A0,20 min后,重復之前操作,測定吸光度,記為A20。乳化性和乳化穩定性計算分別如公式(2)(3)所示：

(2)

(3)

式中：φ,油相體積分數(油的體積/乳化體系的體積,1/3)；ρ,蛋白質質量濃度,g/L；A0和A20為乳化體系分別在0、20 min時的吸光度；N為稀釋倍數,此處的稀釋倍數為50。

1.2.10 起泡性與泡沫穩定性

蛋白質的起泡性和泡沫穩定性的測定參照付本寧[25]的方法測定。統一調節共聚物蛋白質溶液的終質量濃度為3.0 mg/mL,記錄起始溶液體積為V0,在均質機中,以10 000 r/min均質2 min,測量蛋白質溶液和泡沫的總體積,計為V1,30 min后,再次測量蛋白溶液和泡沫的總體積,計為V2。

起泡性、泡沫穩定性計算分別如公式(4)和公式(5)所示：

(4)

(5)

式中：h0,初始時的液面高度,cm；h1,均質后的液面高度,cm；h2,靜置30 min后的液面高度,cm。

1.2.11 流變性的測定

根據FILONZI等[26]的方法,檢測參數：溫度25 ℃,cp50錐板,樣品板與測試板之間的距離0.8 mm,剪切速率掃描范圍0～100 s-1。操作步驟如下：在測試板上滴入2 mL的乳液,保證頂板與樣品液接觸,擦去平板周圍多余的溶液,啟動程序,采集數據。

1.2.12 統計分析

每組實驗重復3次,每次實驗測定3個平行樣,數據作圖使用Origin 8.1軟件,顯著性分析使用SPSS 22.0進行處理(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE

采用SDS-PAGE 法測定BSA-DEX共聚物的分子質量,結果如圖1所示。BSA的分子質量分布于67.2 kDa,與ANTHONY-REGNITZ[27]用電噴霧電離質譜測得的結果(66.4 kDa)相一致；對照 BSA的分子質量條帶沒有發生變化,這說明干熱處理對BSA不產生影響,BSA-DEX共聚物分子質量有明顯的增加。BDC 1的條帶顯示原BSA條帶消失,共聚物BDC 1的分子質量集中分布在77.4 k～95.1 kDa,沒有較大分子質量的共聚蛋白條帶,這可能是因為1 kDa分子質量的DEX有較小的空間位阻,更易與BSA發生反應,但由于BSA含量較少,不足以與1 kDa的DEX完全發生反應[28]；BDC 5的條帶分布在77.4 k～274.4 kDa,出現微弱的漫散射現象。而BDC 70與BDC 100的分子質量分布在68 k～261 kDa,68 kDa處的BSA條帶依舊清晰。

2.2 傅里葉紅外光譜測定

圖2 BSA-DEX共聚物的紅外光譜圖

2.3 接枝度與表面疏水性

如表1所示,不同分子質量的DEX都能與BSA發生接枝反應,接枝度具有顯著的差異。其中BDC 5的接枝度最大,其次是BDC 1,BDC 70和BDC 100的接枝度依次減少。這是因為隨著分子質量的增加,空間位阻也會增加,因此不利于反應基團的相互接觸,從而抑制了反應的進行[32]；相反,分子質量小,空間位阻降低,BSA更易與其發生反應,這時蛋白質的分子量則是影響接枝度的關鍵。分子質量1 kDa的DEX更易與BSA發生反應,但由于BSA的量不足以與DEX完全反應,因此導致接枝度小于BDC 5。

表1 BSA-DEX共聚物的接枝度與表面疏水性

在蛋白質的三級結構中,非極性基團即疏水基團轉向分子內部形成疏水鍵,極性基團即親水基團或者轉向分子內部相互作用形成氫鍵,或者轉向分子表面與極性水分子相互作用[33]。由表1中共聚物的表面疏水性可知,BSA發生接枝反應后形成的共聚物表面疏水性發生不同程度的下降,接枝度越大,下降程度越明顯。當BSA與強親水性的DEX發生接枝反應時,蛋白質的肽鏈中的親水基團增加,蛋白質表面的親水性增強；另一方面蛋白質結構發生伸展,使得蛋白質分子內部的極性基團暴露,從而疏水性降低[34]。蛋白質接入的糖鏈越多,接枝度越大,其親水性越強,表面疏水性就越小。

2.4 熒光強度

含芳香族氨基酸殘基(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的蛋白質在280或295 nm的激發光下會產生內源性熒光。其中色氨酸的熒光峰位波長位于348 nm,熒光強度也是最大,因而也是研究蛋白質的結構是否發生變化的主要的內源探針。BSA的一級序列中含有2個色氨酸殘基：一個位于疏水區域,另一個位于親水區域的表面[35]。圖3表示 BSA與DEX形成共聚物后的熒光強度,其中BSA的熒光強度最大,BSA與DEX共聚物熒光強度發生不同程度的降低,BDC 5的熒光強度降低最為明顯,且接枝度越高,熒光強度的降低越明顯。這是因為接枝反應后,多糖對蛋白質本身含有的色氨酸殘基形成掩蔽作用,從而引起了最大熒光強度的降低。SUN等[36]在對卵清蛋白與多糖的接枝反應研究中發現共聚物的熒光強度的降低；趙城彬[33]研究發現接枝度越大,DEX與玉米醇溶蛋白共聚物的熒光強度降低越明顯。這與本文的研究結果相對應。

圖3 BSA-DEX共聚物的熒光強度

BSA-DEX共聚物的最大熒光強度所對應的波長見表2,BSA與 DEX 形成共聚物的λmax相比于BSA都發生了偏移,其中,BDC 5的偏移現象最為明顯,結合接枝度結果可以發現,BDC 5的接枝度最高。這說明BSA與 DEX發生接枝反應后,會引起蛋白質的三級結構發生改變。SPOTTI等[37]在乳清蛋白-葡聚糖接枝物的熒光光譜分析中發現,共價接枝后λmax發生紅移,接枝度越大,偏移現象越明顯。

表2 BSA-DEX共聚物的最大熒光強度及對應的波長

2.5 色差和褐變程度

在接枝反應期間,蛋白質和多糖會因為美拉德反應形成褐色復合物,可通過測定色度分析樣品的色澤變化和褐變程度。由表3可知,與BSA相比,BSA-DEX共聚物的接枝度越高,L*(明暗值)降低越明顯,而a*(紅綠值)和b*(黃藍值)顯著增加(P<0.05),發生顯著褐變。其中BDC 5的變化尤為明顯,與接枝度的分析結果相對應。這說明分子質量為5 kDa的多糖在與蛋白接枝反應中能夠暴露出更多活性羰基,使活性中間產物的含量增加,并與其他活性前體發生連接和聚合,最后在美拉德反應的最終階段形成較多的褐色聚合物[38]。

表3 BSA-DEX共聚物的色差數據及褐變程度

2.6 乳化性和乳化穩定性

乳化性是蛋白質重要的功能特性之一,對蛋白質的加工應用具有重要的意義[39]。如圖4所示,BSA-DEX 共聚物的乳化性和乳化穩定性較BSA均有顯著增加。其中BDC 5的乳化性最好為(49.06±0.85)m2/g,而乳化穩定性較其他共聚物而言較小。這是因為蛋白質與多糖發生接枝反應后,空間結構變的松散,疏水基團暴露,改變了蛋白質中親水基團和疏水基團之間的平衡,降低蛋白乳液的界面張力,最終使得乳化性升高[40]。BDC乳化性的變化,與接枝度的大小相關,接枝度越大,乳化性越強。

BDC 70和BDC 100的乳化穩定性最大,這是因為多糖的分子質量越大,空間位阻作用越大,穩定性就越好。PUGNALONI[34]研究表明,蛋白質-多糖接枝物能夠在液滴附近形成混合的多分子層結構,從而降低液滴的聚集程度,達到改善乳化性的目的。

2.7 起泡性與泡沫穩定性

圖5為BDC的起泡性與泡沫穩定性曲線,接枝后共聚物的起泡性較BSA顯著降低,而泡沫穩定性顯著升高。BDC 5的起泡性最低,泡沫穩定性最大。蛋白質結構越疏松,起泡性就越好；相反蛋白質分子結構越緊密,剛性越好,越難變形,則蛋白質的起泡性越低[41]。蛋白質分子中暴露在表面的疏水性氨基酸數量也影響著起泡能力。結合分析可得,干熱法接枝產物雖溶解度有所提高,但其蛋白分子是一類結構緊密、剛性強、難于變形的分子,因而無法迅速吸附在氣-水界面上展開形成有序的蛋白分子層,起泡能力差,其泡沫體積保留量也少。

圖5 BSA-DEX共聚物的起泡性與泡沫穩定性

2.8 流變性

如圖7所示,BSA-DEX共聚物的乳液黏度隨著剪切速率的增加而降低,最終達到平衡,此為典型的牛頓流體特性；隨著 DEX 分子質量的增大黏度也在升高。DEX接入BSA后,其本身具有增稠作用,引起了乳液體系黏度的增加,生成了更加穩定的共聚物,增強了在乳液體系中的相互作用和抗剪切作用力,從而引起黏度增大[42]。LIU等[43]對核桃乳狀液的研究發現,高黏度乳液能夠阻礙液滴的相互聚集,從而提高乳狀液的物理穩定性。

圖7 BSA-DEX共聚物的乳液黏度隨剪切速率的變化

3 結論

接枝反應后,SDS-PAGE和FTIR分析證明了BSA與不同分子質量 DEX 均形成了共聚物,且共聚物的結構和功能特性較BSA發生了明顯的變化。接枝度越高的共聚物 (BDC 1、BDC 5)結構變化越明顯,顏色越深,疏水性降低越顯著,BDC 5疏水性為(6.876±0.69)。熒光光譜分析表明,不同分子質量的BDC共聚物均能夠導致熒光猝滅的發生,低分子質量 DEX(1 kDa、5 kDa)與BSA形成的共聚物熒光猝滅現象更顯著,且最大發射波長的紅移程度變化越大,說明較高接枝度的BDC共聚物具有更松散的三級結構。乳化性分析表明,接枝反應能夠提高BSA的乳化性(29.321±0.89) m2/g和乳化穩定性(32.034±0.99)min,并且乳化性隨著接枝度的增加而增加,BDC 5的乳化性達到(49.058±0.88)m2/g,而高分子質量 DEX 與BSA形成的共聚物具有更高的乳化穩定性(57.357±0.47)min和黏度,這是因為高分子質量的DEX具有較高的空間位阻,會對乳液中液滴的聚集起到抑制的作用,增加乳液黏度,利于BDC共聚物乳液的穩定。