牦牛乳酪蛋白水解制備DPP-IV抑制肽的蛋白酶發(fā)掘及其酶解工藝優(yōu)化

王玲麗,劉同杰,張?zhí)m威,公丕民,易華西

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266000)

糖尿病為全球流行病[1],胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制胰高血糖素的釋放可起到降低血糖的效果,但二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV,EC3.4.14.5)可快速降解GLP-1,不利于其降血糖[2]。DPP-IV抑制肽可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DPP-IV抑制其活性[3]。DPP-IV抑制肽通常含有脯氨酸,該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為篩選或合成DPP-IV抑制肽提供了靶點(diǎn)。牦牛乳酪蛋白富含脯氨酸[4],牦牛乳酪蛋白的木瓜蛋白酶水解物DPP-IV抑制率可達(dá)53.95%[5]。傳統(tǒng)方法對(duì)蛋白酶的篩選具有盲目性,借助生物信息學(xué)手段有望實(shí)現(xiàn)對(duì)利用牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽蛋白酶的快速篩選[6]。此外,酪蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙了其與酶的結(jié)合,不利于肽段釋放。超聲波頻率高、波長(zhǎng)短,可一定程度影響酪蛋白結(jié)構(gòu),使酪蛋白更易與蛋白酶結(jié)合,從而提高酶解效果[7]。超聲波輔助單酶水解已應(yīng)用于生物活性肽的制備,但與多酶水解的聯(lián)合作用尚未見(jiàn)報(bào)道[8-9]。

本研究首先利用生物信息學(xué)方法對(duì)牦牛乳酪蛋白進(jìn)行模擬酶切,篩選制備DPP-IV抑制肽的蛋白酶,并對(duì)單酶和多酶組合水解效果進(jìn)行研究,確定最佳蛋白酶組合。進(jìn)一步利用超聲波預(yù)處理技術(shù)對(duì)組合酶水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,確定制備DPP-IV抑制肽的最佳工藝。本研究可為利用牦牛乳酪蛋白生產(chǎn)DPP-IV抑制肽,實(shí)現(xiàn)我國(guó)牦牛乳的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)原料與試劑

牦牛乳酪蛋白,甘肅華羚乳品股份有限公司；蛋白酶,丹麥Novozymes公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Alpha1-4真空冷凍干燥機(jī),德國(guó)Marin Christ公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎機(jī),寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)工具篩選蛋白酶

1.2.1.1 牦牛乳酪蛋白序列獲取

在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中選取編號(hào)分別為A0A344X7B7(αs1-casein)、A0A344X7B8(αs2-casein)、A0A344X7B9(β-casein)和A0A344X7C0(κ-casein)的牦牛乳酪蛋白主要氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 牦牛乳酪蛋白模擬酶切探究DPP-IV抑制肽釋放情況

利用BIOPEP工具(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)對(duì)牦牛乳酪蛋白模擬酶切,統(tǒng)計(jì)不同酶水解釋放的DPP-IV抑制肽數(shù)量,并以4條序列的相對(duì)含量比αs1-casein∶αs2-casein∶β-casein∶κ-casein=4.3∶1.2∶3.2∶1.3進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)算后排序[10]。

1.2.2 模擬酶切結(jié)果驗(yàn)證及蛋白酶篩選

1.2.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解

將牦牛乳酪蛋白用蒸餾水濕潤(rùn)后添加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3,攪拌3 h至完全溶解。蛋白質(zhì)溶液在不同蛋白酶的最適溫度下(表1)預(yù)熱30 min后開(kāi)始酶解,反應(yīng)過(guò)程中用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液穩(wěn)定pH。酶解結(jié)束后,酶解液經(jīng)沸水浴10 min滅酶,冰水浴迅速冷卻,8 000 r/min,4 ℃離心15 min后取上清液,調(diào)節(jié)pH至8.0后凍干,保存于-20 ℃冰箱。

表1 各蛋白酶最適反應(yīng)條件

1.2.2.2 酶解產(chǎn)物上清液蛋白含量測(cè)定

操作步驟按照碧云天公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2.3 酶解產(chǎn)物上清液水解度測(cè)定

采用茚三酮比色法[11]。按公式(1)計(jì)算：

DH/%=

(1)

式中：DH,水解度,%；htot,每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵量,mmol/g。

1.2.2.4 酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率測(cè)定

利用發(fā)色底物法測(cè)定酶解產(chǎn)物離心上清液凍干粉的DPP-IV抑制率[6]。按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A樣品,樣品吸光度；A樣品空白對(duì)照,以緩沖液代替DPP-IV溶液所測(cè)吸光度；A陰性對(duì)照,以緩沖液代替樣品所測(cè)吸光度；A陰性空白對(duì)照,以緩沖液代替DPP-IV溶液和樣品所測(cè)吸光度。

1.2.3 組合酶優(yōu)化水解工藝

雙酶組合：以堿性蛋白酶酶解0.5 h后的樣品為底物,調(diào)節(jié)pH和溫度后分別加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰凝乳蛋白酶進(jìn)行水解。

三酶組合：以依次用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解0.5 h后的樣品為底物,調(diào)節(jié)pH和溫度后分別加入胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰凝乳蛋白酶進(jìn)行水解。

1.2.4 超聲波預(yù)處理優(yōu)化水解工藝

對(duì)牦牛乳酪蛋白溶液進(jìn)行超聲波預(yù)處理：超聲波溫度64 ℃、超聲波功率460 W、超聲波時(shí)間82 min[12]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素ANOVA方差分析,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD),以不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。除模擬酶切外,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳酪蛋白模擬酶切生成DPP-IV抑制肽的研究

檢索統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),BIOPEP中有28種酶可對(duì)牦牛乳酪蛋白產(chǎn)生酶切作用,釋放的DPP-IV抑制肽數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)合酶獲取難易程度和DPP-IV抑制肽數(shù)量,選取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶用于水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽。

表2 BIOPEP對(duì)牦牛乳酪蛋白模擬酶切所產(chǎn)生的DPP-IV抑制肽數(shù)量*

2.2 單酶酶解生成DPP-IV抑制肽驗(yàn)證研究

對(duì)所篩選的5種蛋白酶酶解牦牛乳酪蛋白生成DPP-IV抑制肽的效果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種蛋白酶水解產(chǎn)物均具有DPP-IV抑制活性(圖1-a)。木瓜蛋白酶產(chǎn)物的DPP-IV抑制率最高,為(20.35±0.47)%,堿性蛋白酶的水解度最高,為(58.20±0.57)%,3 h后各蛋白酶基本完成水解。水解度與產(chǎn)物DPP-IV抑制率之間無(wú)明顯聯(lián)系(圖1-a和圖1-b),水解度達(dá)最大值時(shí)DPP-IV抑制肽已基本釋放完全,這與KARIMI等[13]的研究結(jié)果相同。

a-DPP-IV抑制率曲線；b-水解度曲線

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),實(shí)際酶解與模擬酶切結(jié)果并不完全一致。這可能是酶解反應(yīng)條件和底物特性等多種因素的影響,如酪蛋白凝乳不利于蛋白酶發(fā)揮作用[14]。此外,目前僅可統(tǒng)計(jì)模擬酶切產(chǎn)物的DPP-IV抑制肽數(shù)量,數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少單個(gè)肽的活性信息[15]。模擬酶切工具僅基于已報(bào)道過(guò)的酶解位點(diǎn)和DPP-IV抑制肽數(shù)量,而實(shí)際酶解過(guò)程更為復(fù)雜[16]。

2.3 多酶水解生成DPP-IV抑制肽的組合優(yōu)化

2.3.1 雙酶組合優(yōu)化

對(duì)雙酶組合水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶組合的酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高(圖2-a),為(19.77±2.14)%。雙酶組合的水解度較堿性蛋白酶單獨(dú)酶解時(shí)均有顯著提高(圖2-b)。雙酶組合過(guò)程中,反應(yīng)條件的變化和第2種蛋白酶的加入都可能會(huì)影響酪蛋白底物的結(jié)構(gòu),抑制堿性蛋白酶的進(jìn)一步水解[17]。不同蛋白酶的特異性酶解位點(diǎn)有所差異,第2種蛋白酶會(huì)進(jìn)一步釋放堿性蛋白酶產(chǎn)物中的DPP-IV抑制肽[18]。

a-雙酶產(chǎn)物DPP-IV抑制率；b-雙酶產(chǎn)物水解度“堿”表示堿性蛋白酶;“胃”表示胃蛋白酶;“木”表示木瓜蛋白酶;“菠”表示菠蘿蛋白酶;“凝”表示胰凝乳蛋白酶(下同)

2.3.2 三酶組合優(yōu)化

對(duì)三酶組合水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,“堿+木+菠”組合酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率顯著提升,抑制率最高(25.29±3.55)%,但其水解度并未提高。在堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶組合的過(guò)程中,酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率不斷提升,三酶組合>雙酶組合>單酶(圖2-a和圖3-a),但水解度依次為雙酶組合>三酶組合>單酶(圖2-b和圖3-b),表明水解度與產(chǎn)物的DPP-IV抑制活性之間無(wú)必然聯(lián)系。因此,在酶解法制備DPP-IV抑制肽的過(guò)程中,水解度僅可作為控制酶解程度的指標(biāo)[19]。

a-三酶產(chǎn)物DPP-IV抑制率；b-三酶產(chǎn)物水解度

2.4 超聲波預(yù)處理結(jié)合三酶組合優(yōu)化水解

牦牛乳酪蛋白以穩(wěn)定的膠束狀態(tài)存在,不利于與蛋白酶的結(jié)合[20]。超聲波處理可對(duì)酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,增加酪蛋白溶解度并減小酪蛋白膠束尺寸[21]。預(yù)處理結(jié)果表明,超聲波有助于牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽。結(jié)合超聲波預(yù)處理牦牛乳酪蛋白,牦牛乳水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率為(67.05±0.79)%,水解度為(30.57±0.72)%,與未經(jīng)超聲波處理相比,抑制效果與水解度均顯著提高(圖4)。

a-超聲結(jié)合三酶產(chǎn)物DPP-IV抑制率；b-超聲結(jié)合三酶產(chǎn)物水解度

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)工具模擬酶切,篩選獲得了可用于水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶。多酶水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果優(yōu)于單酶水解產(chǎn)物,最佳酶組合為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。確定了組合酶水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的最佳工藝為超聲溫度64 ℃、超聲功率460 W、超聲波時(shí)間82 min,堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶依次酶解0.5 h,加酶量3 000 U/g,酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率為(67.05±0.79)%,水解度為(30.57±0.72)%。本研究將組合酶水解方法應(yīng)用于酶解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的研究,并利用超聲預(yù)處理進(jìn)行了工藝優(yōu)化,明顯提高了酶解效果。