牦牛乳酪蛋白水解制備DPP-IV抑制肽的蛋白酶發掘及其酶解工藝優化

王玲麗,劉同杰,張蘭威,公丕民,易華西

(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266000)

糖尿病為全球流行病[1],胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)通過競爭性抑制胰高血糖素的釋放可起到降低血糖的效果,但二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV,EC3.4.14.5)可快速降解GLP-1,不利于其降血糖[2]。DPP-IV抑制肽可通過競爭性結合DPP-IV抑制其活性[3]。DPP-IV抑制肽通常含有脯氨酸,該結構特點為篩選或合成DPP-IV抑制肽提供了靶點。牦牛乳酪蛋白富含脯氨酸[4],牦牛乳酪蛋白的木瓜蛋白酶水解物DPP-IV抑制率可達53.95%[5]。傳統方法對蛋白酶的篩選具有盲目性,借助生物信息學手段有望實現對利用牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽蛋白酶的快速篩選[6]。此外,酪蛋白的高級結構阻礙了其與酶的結合,不利于肽段釋放。超聲波頻率高、波長短,可一定程度影響酪蛋白結構,使酪蛋白更易與蛋白酶結合,從而提高酶解效果[7]。超聲波輔助單酶水解已應用于生物活性肽的制備,但與多酶水解的聯合作用尚未見報道[8-9]。

本研究首先利用生物信息學方法對牦牛乳酪蛋白進行模擬酶切,篩選制備DPP-IV抑制肽的蛋白酶,并對單酶和多酶組合水解效果進行研究,確定最佳蛋白酶組合。進一步利用超聲波預處理技術對組合酶水解過程進行優化,確定制備DPP-IV抑制肽的最佳工藝。本研究可為利用牦牛乳酪蛋白生產DPP-IV抑制肽,實現我國牦牛乳的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗原料與試劑

牦牛乳酪蛋白,甘肅華羚乳品股份有限公司；蛋白酶,丹麥Novozymes公司。

1.1.2 主要儀器與設備

Alpha1-4真空冷凍干燥機,德國Marin Christ公司；Multiskan FC酶標儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎機,寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學工具篩選蛋白酶

1.2.1.1 牦牛乳酪蛋白序列獲取

在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中選取編號分別為A0A344X7B7(αs1-casein)、A0A344X7B8(αs2-casein)、A0A344X7B9(β-casein)和A0A344X7C0(κ-casein)的牦牛乳酪蛋白主要氨基酸序列進行后續實驗。

1.2.1.2 牦牛乳酪蛋白模擬酶切探究DPP-IV抑制肽釋放情況

利用BIOPEP工具(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)對牦牛乳酪蛋白模擬酶切,統計不同酶水解釋放的DPP-IV抑制肽數量,并以4條序列的相對含量比αs1-casein∶αs2-casein∶β-casein∶κ-casein=4.3∶1.2∶3.2∶1.3進行加權平均計算后排序[10]。

1.2.2 模擬酶切結果驗證及蛋白酶篩選

1.2.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解

將牦牛乳酪蛋白用蒸餾水濕潤后添加5%(質量分數)Na2CO3,攪拌3 h至完全溶解。蛋白質溶液在不同蛋白酶的最適溫度下(表1)預熱30 min后開始酶解,反應過程中用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液穩定pH。酶解結束后,酶解液經沸水浴10 min滅酶,冰水浴迅速冷卻,8 000 r/min,4 ℃離心15 min后取上清液,調節pH至8.0后凍干,保存于-20 ℃冰箱。

表1 各蛋白酶最適反應條件

1.2.2.2 酶解產物上清液蛋白含量測定

操作步驟按照碧云天公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行。

1.2.2.3 酶解產物上清液水解度測定

采用茚三酮比色法[11]。按公式(1)計算：

DH/%=

(1)

式中：DH,水解度,%；htot,每克原料蛋白質的肽鍵量,mmol/g。

1.2.2.4 酶解產物DPP-IV抑制率測定

利用發色底物法測定酶解產物離心上清液凍干粉的DPP-IV抑制率[6]。按公式(2)計算：

(2)

式中：A樣品,樣品吸光度；A樣品空白對照,以緩沖液代替DPP-IV溶液所測吸光度；A陰性對照,以緩沖液代替樣品所測吸光度；A陰性空白對照,以緩沖液代替DPP-IV溶液和樣品所測吸光度。

1.2.3 組合酶優化水解工藝

雙酶組合：以堿性蛋白酶酶解0.5 h后的樣品為底物,調節pH和溫度后分別加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰凝乳蛋白酶進行水解。

三酶組合：以依次用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解0.5 h后的樣品為底物,調節pH和溫度后分別加入胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰凝乳蛋白酶進行水解。

1.2.4 超聲波預處理優化水解工藝

對牦牛乳酪蛋白溶液進行超聲波預處理：超聲波溫度64 ℃、超聲波功率460 W、超聲波時間82 min[12]。

1.2.5 數據處理

使用SPSS 22.0進行單因素ANOVA方差分析,數據結果表示為平均值±標準偏差(SD),以不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。除模擬酶切外,所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳酪蛋白模擬酶切生成DPP-IV抑制肽的研究

檢索統計發現,BIOPEP中有28種酶可對牦牛乳酪蛋白產生酶切作用,釋放的DPP-IV抑制肽數量統計結果見表2。結合酶獲取難易程度和DPP-IV抑制肽數量,選取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶用于水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽。

表2 BIOPEP對牦牛乳酪蛋白模擬酶切所產生的DPP-IV抑制肽數量*

2.2 單酶酶解生成DPP-IV抑制肽驗證研究

對所篩選的5種蛋白酶酶解牦牛乳酪蛋白生成DPP-IV抑制肽的效果進行了驗證,結果發現5種蛋白酶水解產物均具有DPP-IV抑制活性(圖1-a)。木瓜蛋白酶產物的DPP-IV抑制率最高,為(20.35±0.47)%,堿性蛋白酶的水解度最高,為(58.20±0.57)%,3 h后各蛋白酶基本完成水解。水解度與產物DPP-IV抑制率之間無明顯聯系(圖1-a和圖1-b),水解度達最大值時DPP-IV抑制肽已基本釋放完全,這與KARIMI等[13]的研究結果相同。

a-DPP-IV抑制率曲線；b-水解度曲線

同時研究發現,實際酶解與模擬酶切結果并不完全一致。這可能是酶解反應條件和底物特性等多種因素的影響,如酪蛋白凝乳不利于蛋白酶發揮作用[14]。此外,目前僅可統計模擬酶切產物的DPP-IV抑制肽數量,數據庫中缺少單個肽的活性信息[15]。模擬酶切工具僅基于已報道過的酶解位點和DPP-IV抑制肽數量,而實際酶解過程更為復雜[16]。

2.3 多酶水解生成DPP-IV抑制肽的組合優化

2.3.1 雙酶組合優化

對雙酶組合水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽進行了研究。結果表明,木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶組合的酶解產物DPP-IV抑制率最高(圖2-a),為(19.77±2.14)%。雙酶組合的水解度較堿性蛋白酶單獨酶解時均有顯著提高(圖2-b)。雙酶組合過程中,反應條件的變化和第2種蛋白酶的加入都可能會影響酪蛋白底物的結構,抑制堿性蛋白酶的進一步水解[17]。不同蛋白酶的特異性酶解位點有所差異,第2種蛋白酶會進一步釋放堿性蛋白酶產物中的DPP-IV抑制肽[18]。

a-雙酶產物DPP-IV抑制率；b-雙酶產物水解度“堿”表示堿性蛋白酶;“胃”表示胃蛋白酶;“木”表示木瓜蛋白酶;“菠”表示菠蘿蛋白酶;“凝”表示胰凝乳蛋白酶(下同)

2.3.2 三酶組合優化

對三酶組合水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽進行了研究。結果顯示,“堿+木+菠”組合酶解產物DPP-IV抑制率顯著提升,抑制率最高(25.29±3.55)%,但其水解度并未提高。在堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶組合的過程中,酶解產物的DPP-IV抑制率不斷提升,三酶組合>雙酶組合>單酶(圖2-a和圖3-a),但水解度依次為雙酶組合>三酶組合>單酶(圖2-b和圖3-b),表明水解度與產物的DPP-IV抑制活性之間無必然聯系。因此,在酶解法制備DPP-IV抑制肽的過程中,水解度僅可作為控制酶解程度的指標[19]。

a-三酶產物DPP-IV抑制率；b-三酶產物水解度

2.4 超聲波預處理結合三酶組合優化水解

牦牛乳酪蛋白以穩定的膠束狀態存在,不利于與蛋白酶的結合[20]。超聲波處理可對酪蛋白膠束的結構產生影響,增加酪蛋白溶解度并減小酪蛋白膠束尺寸[21]。預處理結果表明,超聲波有助于牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽。結合超聲波預處理牦牛乳酪蛋白,牦牛乳水解產物的DPP-IV抑制率為(67.05±0.79)%,水解度為(30.57±0.72)%,與未經超聲波處理相比,抑制效果與水解度均顯著提高(圖4)。

a-超聲結合三酶產物DPP-IV抑制率；b-超聲結合三酶產物水解度

3 結論

利用生物信息學工具模擬酶切,篩選獲得了可用于水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶。多酶水解產物的DPP-IV抑制效果優于單酶水解產物,最佳酶組合為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。確定了組合酶水解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的最佳工藝為超聲溫度64 ℃、超聲功率460 W、超聲波時間82 min,堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶依次酶解0.5 h,加酶量3 000 U/g,酶解產物DPP-IV抑制率為(67.05±0.79)%,水解度為(30.57±0.72)%。本研究將組合酶水解方法應用于酶解牦牛乳酪蛋白制備DPP-IV抑制肽的研究,并利用超聲預處理進行了工藝優化,明顯提高了酶解效果。