高溫濕熱處理對大豆分離蛋白的結構及其功能特性的影響

劉紫薇,朱明明,王鳳新,趙強*,熊華

1(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學),江西 南昌,330047) 2(江西人之初營養科技股份有限公司,江西 南昌,330052)

大豆蛋白是優質植物蛋白的代表,兼具高營養價值和多種功能性質,在食品中的應用十分廣泛[1]。大豆蛋白在市場上有3種常見形式,即大豆粉、大豆濃縮蛋白、大豆分離蛋白。其中大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)是以低溫脫脂豆粕為原料,進一步除去非蛋白質成分后得到的、蛋白質含量達90%(干基)以上的一種全價蛋白[2]。在SPI的生產及相關制品應用過程中,熱處理是不可避免的環節,通常會出現大豆蛋白結構展開,發生不可逆的熱聚集，即熱變性現象,引起蛋白功能性質的明顯改變,從而影響其應用[3]。陶汝青等[4]研究了熱處理對大豆蛋白結構及其凝膠性質的影響,發現處理時間相同的條件下,隨著加熱溫度的升高,SPI的β-折疊含量下降,無規卷曲含量增加,形成凝膠的強度也隨之增強。王健等[5]研究了熱處理對大豆蛋白柔性和結構的關系,發現對樣品的熱處理溫度>80 ℃時,蛋白的柔性與溫度和處理時間呈正相關,其起泡性和乳化性也隨著溫度的升高和處理時間的延長而提高。齊寶坤等[6]研究了熱處理對大豆11S球蛋白溶解性和二級結構的影響,結果表明,80 ℃熱處理會導致11S球蛋白的α-螺旋轉化為β-折疊和無規卷曲結構,其溶解度明顯降低；90和100 ℃熱處理后,11S球蛋白會形成可溶性聚集體,其溶解度升高。SIRISON等[7]發現90 ℃處理顯著提高了大豆蛋白的溶解度,從42%增加到85%。目前實驗室條件下對SPI的熱處理主要集中在不高于100 ℃的常壓熱處理,實際上工業生產中如噴射蒸煮溫度最高可達154 ℃,高于154 ℃的高溫濕熱處理對SPI結構及功能是否會產生影響,相關研究文獻報道較少[8]。

本文以SPI為研究對象,選取SPI的2個玻璃化轉變溫度附近的70與90 ℃[9]以及120、150、170、200 ℃下分別濕熱處理30 min,研究高溫濕熱處理對SPI結構與功能的影響,為大豆蛋白及其制品在生產中的改性應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕,哈高科大豆食品有限責任公司；1-苯胺基-8-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、福林酚試劑、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、鹽酸、異辛烷、異丙醇、甲醇、硫氰酸銨、BaCl2、三氯乙酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T18高速分散機、RH Basic I磁力攪拌器,德國IKA公司；聚四氟乙烯高壓反應釜(50 mL),鄭州博科儀器有限公司；F—7000熒光分光光度計,日本日立公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Fisher公司；Mini-PROTEAN電泳儀,美國伯樂公司；新世紀T6紫外-可見光分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；Zetasizer Nano粒度電位儀,英國馬爾文公司；Synergy H1酶標儀,美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI的制備

SPI的制備采用堿提酸沉法[8]并稍作改動。稱取適量脫脂大豆粉,按料液比1∶10(g∶mL)加入去離子水,用1 mol/L NaOH溶液調pH至8.0,室溫下機械攪拌2 h,離心(8 000×g,20 min),重復提取殘渣1次,合并上清液待用。用2 mol/L 的HCl溶液將上清液pH調至4.5,靜置0.5 h后再次離心(5 000×g,20 min),所得沉淀經水洗2次后,再次離心(5 000×g,20 min),向所得殘渣中加入適量去離子水,所得分散體在去離子水中透析24 h(透析袋截留分子質量：8 k～14 kDa),隔6 h換1次水。經冷凍干燥后,置于-18 ℃冰箱保存備用。樣品經凱氏定氮儀測定大豆蛋白純度為95%(干基,N%×6.25)。

1.3.2 高溫濕熱處理

配制質量濃度為1 g/100 mL的SPI溶液,用1 mol/L HCl溶液及1 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0,取10 mL樣品置于50 mL聚四氟乙烯高壓反應釜中,分別在70、90、120、150、170、200 ℃條件下處理30 min,樣品分別命名為SPI-70、SPI-90、SPI-120、SPI-150、SPI-170、SPI-200,未經處理的樣品命名為Native作為對照。取出后立即冰浴,冷卻至室溫后冷凍干燥待用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)

參考文獻[10-11]的方法稍作修改。樣品溶解于含二硫蘇糖醇(DTT)的上樣緩沖液(2 mg/mL),沸水浴10 min后離心(8 000×g)10 min。上樣量為10 μL,采用5%的濃縮膠和12%的分離膠,并在恒定電流條件下進行電泳,濃縮膠電流為20 mA,分離膠電流為25 mA。結束電泳后采用質量分數0.25%的考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h,再采用含有甲醇和乙酸的混合液[V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(水)=50∶75∶875]脫色12 h。

1.3.4 色氨酸熒光光譜測定

稱取適量處理前后的SPI樣品分散于0.01 mol/L,pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中,配制成濃度為1 mg/mL的蛋白溶液。采用熒光分光光度計在激發波長為290 nm條件下,以20 nm/s的掃描速度得到300～400 nm的發射光譜。其中激發狹縫和發射狹縫寬均為5 nm。

1.3.5 傅里葉紅外(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)光譜測定

將凍干的SPI樣品與KBr進行干燥處理,取5 mg樣品粉末與200 mg KBr混合,研磨均勻,然后壓片,通過FTIR記錄每個樣品在4 000～400 cm-1的透過率光譜圖,分辨率 4 cm-1,掃描32次。譜圖采用Omnic 8.0和Peakfit 4.12軟件進行分析,包括在酰胺Ι帶(1 700～1 600 cm-1)范圍內進行兩點基線校正、平滑處理、去卷積、作二階導數同時采用Gaussian法進行多次曲線擬合,使殘差R2最小；最后將擬合出的子峰歸屬給蛋白的4種二級結構,并通過計算各子峰面積百分比推導蛋白樣品的二級結構組成。各子峰與二級結構對應關系：1 660～1 650 cm-1為α-螺旋;1 640～1 610 cm-1為β-折疊;1 700～1 661 cm-1為β-轉角;1 650～1 640 cm-1為無規卷曲[6]。

1.3.6 表面疏水性測定

參考KATO等[12]的方法采用ANS熒光探針法測定蛋白的表面疏水性,稍作修改。將未處理和濕熱處理后的SPI樣品溶解于0.01 mol/L,pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中,最終質量濃度范圍為0.1～2.0 mg/mL。取樣品液2 mL,加入50 μL,8 mmol/L的ANS溶液振蕩,黑暗處靜置5 min。設定激發波長為360 nm,通過熒光分光光度計記錄在480 nm處的熒光強度,其中激發和發射狹縫寬度均為5 nm。通過熒光強度對蛋白質濃度作線性回歸分析,曲線初始階段的斜率即為蛋白質的表面疏水性指數。

1.3.7 溶解度的測定

蛋白質溶解度依照ZHAO等[13]的方法,稍作修改。常溫下,取0.2 g樣品分散在20 mL去離子水中,攪拌30 min后調節pH至中性,再攪拌30 min,離心(5 000×g,10 min)后取適量上清液稀釋,以BSA為標準蛋白,用Lowry法測定上清液中蛋白質量。按公式(1)計算溶解度:

(1)

1.3.8 粒徑及電位的測定

采用粒度電位儀對SPI樣品進行粒徑及Zeta電位測定。材料折射率為1.450,分散介質設定為水。用去離子水將樣品稀釋至1 mg/mL,在25 ℃下平衡120 s后開始測試。

1.3.9 濁度的測定

參考LIU等[14]的方法測定樣品濁度,略作改動。用去離子水將樣品稀釋為5 mg/mL,將200 μL待測樣品滴加到96孔板中,利用酶標儀在波長600 nm下測定吸光度值,用去離子水作為空白對照。A600值即為濁度值。

1.3.10 乳化性及乳化穩定性的測定

采用比濁法測定乳化性及乳化穩定性。在圓底離心管中加入16 mL蛋白質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液和4 mL大豆油,用高速分散機以12 000 r/min高速剪切1 min,隨即從距底部0.5 cm處取50 μL乳狀液,加入5 mL SDS(1 g/L)溶液進行稀釋,渦旋振蕩混勻。采用紫外分光光度計在500 nm處測定吸光值A0,10 min后再次移取50 μL混勻的乳狀液,用SDS溶液稀釋后測定其吸光值A10,同時做空白。按公式(2)、(3)計算乳化性及乳化穩定性:

(2)

(3)

式中：ρ,形成溶液前樣品溶液質量濃度,g/mL；D,稀釋倍數；φ,油相所占體積分數,0.20。

1.3.11 統計分析

樣品測試均進行3組平行實驗。結果以“平均值±標準偏差”表示,采用OriginPro 2020軟件作圖及ANOVA Tukey分析實驗數據,圖表中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

7S球蛋白和11S球蛋白占比超過大豆蛋白總量的80%,是其重要組成部分。7S球蛋白由3個亞基通過非共價作用組成,α亞基(67 kDa),α′亞基(71 kDa)和β亞基(50 kDa)。11S球蛋白是由6個不同亞基組成的六聚體,每個亞基由1個分子質量約為35 kDa的酸性亞基A(酸性pI)和1個分子質量約為20 kDa的堿性亞基B(堿性pI)通過二硫鍵連接而成[1]。

圖1為經過不同溫度濕熱處理后的SPI電泳圖。電泳圖譜顯示,熱處理溫度超過90 ℃,分離膠條帶,尤其是低分子質量條帶(75 k、63 k、48 k、35 kDa)的顏色逐漸加深,濃縮膠和分離膠交界處的聚集體的量也隨之增加。當熱處理溫度>150 ℃時,觀察到各亞基的條帶顏色較淺,與文獻觀察到的結果一致[15],說明熱處理后亞基可能參與聚集體的形成,其中可溶性聚集物形成與酸性亞基A、α亞基和α′亞基相互作用有關,不可溶聚集物與堿性亞基B和β亞基有關[7]。除此之外,SPI的亞基組成無顯著變化,說明不同溫度的處理對SPI的一級結構影響較小,這與射頻加熱得到的結果類似[16]。

1-未經處理的樣品Native；2-SPI-70；3-SPI-90；4-SPI-120；5-SPI-150；6-SPI-170；7-SPI-200

2.2 色氨酸熒光光譜分析

色氨酸(Trp)殘基對微環境的變化十分敏感,因此蛋白質的內源熒光光譜通常用于研究蛋白分子三級結構的變化及蛋白質間的相互作用。激發波長290 nm下,SPI發射的內源熒光主要來自于Trp[17]。高溫濕熱處理對SPI內源熒光的影響如圖2所示,高溫濕熱處理導致SPI的最大熒光發射強度顯著降低,最大發射波長(λmax)從337 nm紅移至351.8 nm,其中200 ℃高溫濕熱處理的紅移程度遠大于其他溫度,表明SPI在此條件下三級結構發生明顯變化。未處理的SPI最大發射波長(λmax)在337.8 nm處且熒光強度最大,表明色氨酸殘基位于SPI的內部疏水區域,這與DUFOUR等[18]的研究結果一致。隨著溫度的提高,蛋白質的變性程度愈大,暴露在表面的Trp殘基愈多,發色團電子躍遷所需能量減少,熒光量子產率降低,導致熒光強度的降低。高溫濕熱處理使Trp殘基從蛋白內部疏水區域轉移至親水區域,暴露在極性的微環境中,從而發射波長λmax發生紅移[19]。

圖2 不同高溫濕熱條件處理的SPI內源熒光光譜圖

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖3為高溫濕熱處理前后SPI的FTIR圖譜。3 600～3 300 cm-1位置的峰強度通常可以表示SPI分子內部及其分子間氫鍵、O—H、C—H鍵伸縮振動的強度[20]。隨著溫度不斷升高,在2 932 cm-1位置的峰幾乎沒有變化,這說明高溫濕熱處理對SPI分子內的C—H鍵產生的影響較小[21]。

圖3 不同高溫濕熱條件處理的SPI紅外光譜圖

表1 通過紅外光譜結果計算的高溫濕熱處理的和未經過處理的SPI的二級結構含量 單位：%

2.4 表面疏水性

高溫濕熱處理對SPI的表面疏水性有明顯的影響,如圖4所示。未經處理的SPI的表面疏水性為96.74,當處理溫度為70～90 ℃時,SPI的疏水性逐漸增強,在90 ℃時達到最大,與顧龍建等[24]的研究結果一致。β-折疊結構易存在于蛋白質聚集體的內部[25],由二級結構含量可知,此溫度下樣品的β-折疊結構含量最低,表明熱處理溫度的提高加劇了蛋白質的變性,更多的疏水基團暴露,從而導致表面疏水性的提高。隨著加熱溫度進一步上升至200 ℃,SPI基團中的亞基間形成更多的聚集體,疏水基團被隱藏至蛋白內部,導致表面疏水性發生一定程度的下降[6]。200 ℃高溫濕熱處理和未處理樣品的疏水性無顯著性差異。

圖4 不同高溫濕熱條件對SPI表面疏水性的影響

2.5 溶解度

溶解度是蛋白質功能性質的一個重要指標,同時決定了蛋白眾多其他功能特性如乳化性等。高溫濕熱處理對SPI溶解性的影響如圖5所示。未處理的蛋白溶解性為70%,SPI被高溫濕熱處理后,其溶解性得到了顯著的提升,且在90 ℃時達到最高為86%。這可能是由于當SPI受熱時,不溶的蛋白聚集體發生解聚,使得溶解性增加,或者是由于加熱處理使得蛋白多肽鏈展開,肽鏈間形成了可溶性的聚集[26-27]。凝膠電泳結果中低分子質量條帶的加深和熒光結果色氨酸微環境極性的增加都表明了高溫熱處理引起蛋白構象的變化,引起溶解性的變化。當處理溫度升至120 ℃時,其溶解度約為59.67%,溶解度明顯降低,過高的加熱溫度使蛋白發生變性,導致蛋白質的聚集和疏水作用提高,從而導致溶解度下降,這與WENG等[26]的研究結果一致。

圖5 不同高溫濕熱條件處理對SPI溶解度的影響

處理溫度進一步提高至200 ℃,其溶解度快速升高；在高溫處理樣品時,可以發現溶液呈均一狀,且無聚集體析出,可能的原因是高溫下SPI內部的7S和11S球蛋白發生結構重組,2類蛋白亞基間發生相互作用形成可溶性聚集體,從而保持較好的溶解性[28]。以上結果表明,SPI的溶解度受溫度影響較大。

2.6 電位

圖6是不同高溫濕熱條件處理后SPI的Zeta電位。SPI是典型的兩性電解質,在中性pH值時,所有SPI樣品的Zeta電位均為負值,說明蛋白質表面存在凈負電荷[29]。隨著濕熱處理溫度的升高,SPI的Zeta電位絕對值呈減小趨勢。這表明SPI表面的帶負電殘基隨著高溫濕熱處理逐漸掩埋,靜電排斥減少,溶液穩定性降低,這將有利于體系中蛋白分子形成聚集體。

圖6 不同高溫濕熱條件處理的SPI的Zeta電位圖

2.7 粒徑

圖7是不同高溫濕熱處理下SPI的平均粒徑,高溫濕熱處理會對SPI平均粒徑產生顯著影響(P<0.05)。70～150 ℃高溫濕熱處理顯著降低SPI的平均粒徑,另一方面,170～200 ℃高溫濕熱處理顯著增大SPI的平均粒徑。周麟依等[30]認為蛋白質粒徑的變化主要與蛋白質分子的交聯與聚集有關,蛋白的平均粒徑較大說明蛋白分子之間相互聚集形成較多聚集體,反之則蛋白間形成較少聚集體。

圖7 不同高溫濕熱條件處理的SPI平均粒徑圖

170、190 ℃高溫濕熱處理形成了3 500～4 000 nm左右的聚集體(P<0.05),表明在較高溫度的濕熱處理下體系發生了明顯的聚集,與在這2個溫度下SPI濁度明顯更高的結果一致。

2.8 濁度

濁度是表征蛋白質聚集程度的關鍵指標,能夠側面反映蛋白在溶液中的分散狀態[31]。圖8是不同高溫濕熱處理后SPI的濁度。由測定結果可知,70～150 ℃高溫濕熱處理對SPI濁度無顯著影響,而170～200 ℃高溫濕熱處理后的樣品濁度顯著增大,CROMWELL等[32]認為濁度的增加和蛋白分子聚集體形成有關。SPI-170、SPI-200濁度的顯著增加與其粒徑顯著增大的結果相互驗證,表明SPI經高溫濕熱處理后形成了聚集體。另一方面,溶解度的測試結果表明在這2個溫度濕熱處理下SPI的可溶性仍然高達80%,這表明形成的聚集體是可溶的。

圖8 不同高溫濕熱處理對SPI濁度(A600)的影響

2.9 乳化性及乳化穩定性

高溫濕熱處理后的SPI溶液乳化性及乳化穩定性如圖9所示。由圖9-a可知,隨著處理溫度的升高,SPI溶液的乳化性呈現出先上升后下降的趨勢,90 ℃時乳化性最大。這是由于適當的溫度處理可使SPI發生熱變性,蛋白的結構展開,β-折疊結構被破壞,含量降低,逐漸轉化為α-螺旋和β-轉角結構,故增加了SPI的柔性[5],更多的疏水性位點被暴露,從而促進其在界面的展開,進而增大了其乳化性。熱處理溫度為120、150、170、200 ℃時,分子熱運動加劇,相互作用的幾率增大,致使其乳化性降低[33]。

a-乳化性；b-乳化穩定性

另一方面,高溫處理蛋白質使其結構過度展開,更多的疏水基團暴露,增強了分子間的相互作用,導致乳化性降低。

圖9-b顯示,隨著處理溫度的升高,大豆分離蛋白的乳化穩定性逐漸升高,這是由于熱處理使得蛋白質分子逐漸展開,分子形態逐漸松散,更多的疏水基團暴露,界面蛋白間疏水作用增強,界面膜厚度增加,油滴間比較穩定,從而增加了體系的乳化穩定性[34],200 ℃高溫濕熱處理的樣品乳化穩定性最強。這表明高溫濕熱處理有利于改善大豆分離蛋白的乳化穩定性。

3 結論

高溫濕熱處理對SPI的結構和功能特性影響顯著。高溫濕熱處理后的SPI一級結構組分無較大的變化；經過熱處理后的SPI結構展開,發色團暴露出來,導致最大吸收波長發生紅移；相較于未處理的樣品,高溫處理的蛋白二級結構中的各個組分的含量發生顯著變化,具體表現為β-折疊含量減少,α-螺旋含量增加。70～90 ℃處理SPI,其溶解度隨溫度升高而增大;SPI-90溶解度最大,SPI-120溶解度最小;SPI經170～200 ℃高溫濕熱處理,溶解度又隨溫度的增高而增大；相較于其他樣品,SPI-170、SPI-200的平均粒徑及濁度顯著增大,SPI聚集程度較大,電位絕對值明顯降低。SPI的表面疏水性和乳化性呈先增加后降低趨勢,處理溫度為90 ℃時達到最大,而乳化穩定性和溫度呈正相關。