四種乳酸菌發酵西梅漿的特性研究

戴志偉,張玥,伊力夏提·艾熱提,嚴宏孟,殷思思,李芳,孔令明*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830000) 2(新疆輕工職業技術學院,新疆 烏魯木齊,830000)

歐洲李(PrunusdomesticaL.),在國內常稱其為西梅,是薔薇科,李屬果樹的果實,富含纖維素、維生素A、鉀、鐵、葉酸等多種營養素及微量元素,被譽為“功能水果”。不同的西梅果實品種在感官特性等方面也有不同[1-2],“法蘭西”西梅硬度小、風味濃甜,極適鮮食；“女神”西梅有機酸含量高、硬度大,但相較其他品種的西梅更便于運輸保藏也有更強的抗氧化活性,適合進行深加工。相關研究已經證實西梅優良的抗氧化特性、輔助治療骨質疏松的作用以及緩解便秘、抗結腸癌、保護心血管等功效[3-5]。新疆有野生種歐洲李的分布[6],是李屬植物的發源地之一,開展西梅的深加工研究可以更好地提高西梅的經濟價值。

西梅鮮果可加工成果脯、果汁、果醬等產品,但目前市場上西梅產品種類較為單一,除鮮食外多制成果干。近年來有關果蔬發酵的研究逐漸增多,益生菌發酵是維持或改善蔬菜、水果以及衍生食品貯藏特性及食用特性最簡單和有價值的生物技術方法。利用乳酸菌發酵果蔬可以提升其抗氧化活性[7],分解大分子營養物質[8],有利于人體吸收消化,同時改善口感增加香氣[9],提高產品的食用價值。VERN等[10]利用乳酸菌發酵仙人掌,發酵產物可以在保存原有營養物質及活性成分的基礎上延長保存期,進一步證實乳酸菌發酵果蔬具有很好的研究價值。

本實驗以新疆“女神”西梅為原料,分別用果蔬發酵常用的植物乳桿菌、研究與應用較為成熟的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌、篩分自與“女神”西梅同產區(喀什)的奶酪樣品中的瑞士乳桿菌對西梅漿進行發酵,探究發酵過程中總酸、總糖、總酚和體外抗氧化活性等變化趨勢,總結4種乳酸菌發酵西梅漿的不同特性及在發酵周期(96 h)內對物質變化的影響,以期為發酵果蔬制品的菌種選擇及加工方向提供參考,對以西梅或李屬植物果實為原料的發酵產品開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

1.1.1 材料與菌種

新疆“女神”西梅,新疆喀什地區伽師縣；保加利亞乳桿菌(LactobacillusbulgaricusJYLB-19)、嗜熱鏈球菌(StreptococcusthermophilusJYSR-26)、植物乳桿菌(LactobacillusplantarumJYLP-326),中科嘉億生物有限公司；瑞士乳桿菌(LactobacillushelveticusA25)(分離自新疆伊犁地區奶酪樣品),實驗室保藏。

1.1.2 試劑

MRS培養基、MRS肉湯培養基,北京奧博星生物技術有限公司；福林酚試劑、蔗糖,北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS],上海源葉生物科技有限公司；H2SO4、水楊酸、FeCl3、K3[Fe(CN)6]等試劑,天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 儀器與設備

VD-850型桌上式(垂直)送風凈化工作臺,蘇州博萊爾凈化設備有限公司；DHP-9162微生物恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司；UV-1200紫外分光光度計,北京普析通用有限責任公司;PHS-3C型雷磁pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌生長曲線的繪制

以體積分數2%的接種量將4種活化后的乳酸菌接入250 mL MRS液體培養基中,以未接種菌種的MRS液體培養基作為空白對照,37 ℃恒溫培養,每隔2 h測定其在600 nm波長處的OD值,菌種進入穩定期后每隔4 h測定。橫坐標為生長時間,縱坐標為吸光度,繪制4株乳酸菌的生長曲線。

1.3.2 發酵種子液的制備

乳酸菌的活化與擴大培養：將保存于斜面的乳酸菌分別接入MRS 固體培養基上,37 ℃恒溫培養,連續傳代活化培養3代,從MRS固體培養基上挑取單菌落菌體,接種至 MRS 液體培養基中,37 ℃ 恒溫培養 24～36 h 后取出,振蕩均勻后,按照體積分數2% 的接種量接種進行擴大培養(37 ℃,24～36 h),得到乳酸菌菌懸液(菌懸液濃度≥1×107CFU/mL)備用。

1.3.3 西梅漿的制備

挑選新鮮、硬度適中、新鮮的“女神”西梅,清水漂洗瀝干、去核,為打漿徹底,按西梅與水1∶1 的質量比進行打漿,加入質量分數0.2%D-異抗壞血酸鈉在打漿過程中進行護色；用 NaHCO3溶液和檸檬酸將西梅漿pH值調節至4.50～5.00,用蔗糖將西梅漿的糖度調節至12°Brix,為殺菌徹底和防止酶促褐變,將西梅漿煮沸3～5 min進行滅菌和滅酶處理,冷卻后放入滅菌的取樣瓶中。

1.3.4 西梅漿的接種和發酵

分別以5%的接種量接種4種乳酸菌,以未接種的西梅漿為空白對照。在37 ℃恒溫培養箱靜置發酵96 h,每24 h取樣1次進行測定,接入菌液后的時間記為0 h。

1.3.5 理化指標的測定

1.3.5.1 pH值的測定

用PHS-3C型pH計直接測定。

1.3.5.2 總酸含量的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》酸堿滴定法[11]。

1.3.5.3 色差的測定

用手持式色差儀測定。其中L*值表示發酵西梅漿的亮度,a*值表示紅色-綠色,b*值表示黃色-藍色。ΔL*、Δa*、Δb*為西梅漿發酵后的L*、a*、b*與發酵0 h時L*、a*、b*的差值。

1.3.5.4 總糖含量的測定

參考曹建康[12]的蒽酮試劑法進行測定。

1.3.5.5 總酚含量的測定

采用福林-酚比色法測定[13],以沒食子酸作為標準品制作標準曲線(y=0.628 9x+0.019 2,R2=0.997 9)。每 1 mL西梅漿發酵液中總多酚含量以沒食子酸記,單位為mg/L,重復3次實驗,取平均值。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測定

根據文獻[14],稍做修改：取2 mL離心后的稀釋發酵液加入新配制的0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL,搖勻后在避光處靜置30 min,后在波長517 nm處測定吸光值。平行測定3次,根據公式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：A1,為發酵液于DPPH溶液反應后的吸光度(樣品組)；A2,為發酵液及2 mL無水乙醇溶液的吸光度(空白組)；A3,為2 mL DPPH溶液及2 mL蒸餾水的吸光度(對照組)。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

根據文獻[15],稍做修改：進行ABTS陽離子自由基清除率測定時用無水乙醇將ABTS工作液的吸光度處調節至(0.70±0.02),此時的液體為ABTS的測定液。以樣品與測定液按1∶3的體積比充分混合,在室溫避光的條件下靜置30 min,在波長為734 nm處測定吸光值。平行測定3次,根據公式(2)計算ABTS陽離子自由基清除率：

(2)

式中：A1,以蒸餾水代替樣品的樣液吸光度(空白組)；A2,樣品為發酵液的樣液吸光度(樣品組)。

1.3.6.3 還原力的測定

根據文獻[16],修改如下：將離心后的發酵液適當稀釋后與2.5 mL質量分數為1%的K3[Fe(CN)6]溶液和2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)混合均勻后于50 ℃水浴20 min,后迅速在4 ℃冰水中冷卻5 min,加入2.5 mL質量分數為10% 的三氯乙酸溶液,均勻混合后3 500 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液,室溫下靜置10 min后在波長700 nm處測定吸光值。平行測定3次,樣品的吸光值越高說明還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌的生長曲線

由圖1所示,保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌在MRS液體培養基中無明顯滯后期,10 h內進入穩定期,從對數生長期進入穩定期的過渡時間較短。其中植物乳桿菌在測試時間內菌體數量最多,保加利亞乳桿菌次之；瑞士乳桿菌與其他3株菌相比,滯后期較長,在20 h才能逐漸進入穩定期,且從對數生長期到穩定期需要一定過渡,測試時間內菌體數量相對較少。因此,保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌相較于瑞士乳桿菌活力更高。

圖1 不同乳酸菌的生長曲線

2.2 不同乳酸菌發酵對西梅漿pH值及總酸含量的影響

初始pH值會影響西梅漿的顏色,在最大限度保證色澤的同時,為給菌種提供合適的初始pH值,選擇用NaHCO3溶液將初始西梅漿的pH值調整為4.5～5。由圖2所示,4株乳酸菌在發酵過程中代謝產生乳酸等有機酸,pH值均降低。其中保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵的西梅漿在24 h內pH值顯著下降,對照圖1的生長曲線,這2株菌在24 h時的菌體數量相對較多。隨著發酵時間的延長,較低的pH逐漸對菌種的活力及代謝能力產生抑制[17],保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵西梅漿的pH值分別在24和48 h后趨于平緩,但一直呈現穩定下降趨勢且最終pH值降至3.6左右。嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌的發酵漿的pH值下降較為平緩,最終的pH值顯著高于植物乳桿菌發酵組。這與黃艷[18]的研究一致,植物乳桿菌相比于其他乳酸菌可把環境pH值降至更低,相關研究報道,利用植物乳桿菌發酵果蔬時,存在蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation,MLF)的降酸過程,但產酸降低pH為主要代謝過程[18]。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

總酸含量的增加是西梅漿發酵過程中,有機酸的逐漸溶出和乳酸菌發酵產酸的共同作用結果[19]。如圖3所示,對照組在0～24 h內總酸含量的輕微增高可能是有機酸溶出的結果。保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌和瑞士乳桿菌的總酸含量隨發酵時間的延長都有所增加,保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵過程中,總酸含量達到10.68和12.11 g/L；瑞士乳桿菌在0～24 h內增長緩慢,與圖1生長曲線中的滯后期相對應。嗜熱鏈球菌發酵組和對照組的總酸在發酵過程中總酸含量差別不大,說明嗜熱鏈球菌在以西梅漿為基質的發酵過程中產酸能力相對較弱。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

2.3 不同乳酸菌發酵對西梅漿色差的影響

西梅漿的顏色受初始pH值的影響,同時也與發酵過程中pH值的變化及酚類物質的類型、含量有關[20-21]。花色苷是西梅果實中主要的呈色物質,溶液的pH值會使花色苷的結構發生轉變,從而體現為顏色的差異,總體上說,花色苷在酸性條件下偏紅,隨著pH值的升高而呈現出無色或偏藍的變化[22-23]。由圖4所示,4株菌在發酵過程中的△L*均高于對照組,說明4種乳酸菌發酵均可提高西梅漿的亮度,保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌在提升亮度方面的作用較為顯著。在發酵過程中,5個發酵組的△a*均升高,說明隨著發酵時間的延長,5組發酵液的顏色均向紅色偏移,植物乳桿菌發酵組在發酵終期的△a*最大,說明植物乳桿菌發酵組的顏色向紅偏移最多,對照發酵漿的pH值變化,植物乳桿菌發酵組的pH值相對最低,說明色度的變化和溶液pH值有關,紅度與菌種產酸性能呈正相關。對照組和4個發酵組的△b*均增加,其中嗜熱鏈球菌發酵組在發酵過程中向黃色偏移較為顯著(P>0.05)。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

2.4 不同乳酸菌發酵對西梅漿總糖含量的影響

如圖5所示,在發酵過程中,對照組的總糖含量變化較小,除瑞士乳桿菌外,其他3個發酵組的總糖含量均在0～24 h內大幅下降,說明處于對數生長期的乳酸菌大量消耗糖類物質,48 h后總糖含量的變化趨于平穩,與菌種逐漸進入穩定期有關,也可能是較低的pH值限制了菌種的生長影響了對糖類的代謝。瑞士乳桿菌發酵組相較于圖1的生長曲線,對于糖的消耗也體現出了明顯的滯后期。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

結合圖2,保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和瑞士乳桿菌發酵組在48 h的pH值(3.95、4.48、3.88、4.42)也說明了4種乳酸菌對pH的耐受性不同,植物乳桿菌相較其他3株菌,可耐受更低pH值的環境,因此在終點的總糖含量最低(71.79 g/L)。且在此時間內植物乳桿菌發酵組的pH值依然在逐漸下降、總酸含量逐漸上升,說明植物乳桿菌仍處于分解代謝中,可進一步推斷植物乳桿菌在較低的pH下進行MLF,在進行糖酵解產生丙酮酸的同時將蘋果酸轉換成乳酸[24],使發酵體系的pH值不斷降低。

2.5 不同乳酸菌發酵對西梅漿中總酚含量的影響

如圖6所示,5組樣品的總酚含量在0～96 h內呈現下降趨勢。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

瑞士乳桿菌發酵組與對照組在前24 h內總酚含量下降趨勢近似且最快；嗜熱鏈球菌發酵組在48 h總酚含量最高(688.95 mg/L),保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵組在48 h時總酚含量均低于嗜熱鏈球菌發酵組,可能因為低pH值環境,產生代謝應激作用,代謝一些酚類物質增強菌種的耐酸性[25]。

在發酵終點(96 h),保加利乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌的總酚含量均高于對照組與有明顯滯后期的瑞士乳桿菌發酵組,說明乳酸菌在生長過程中一定程度減緩了總酚含量的下降,因為隨著乳酸菌的發酵,低pH值的環境可以穩定部分酚類化合物,一些酶的產生可水解植物細胞壁[26],部分酚類物質釋放,同時乳酸菌的發酵也會使植物組織中的結合態酚類化合物向游離態酚類化合物和水溶性酚類化合物轉換[27],因此,乳酸菌發酵過程中,總酚含量是動態下降過程。圖6總酚含量的趨勢與發酵蘋果[24,28]的趨勢一致,但與發酵藍莓[29]、柑橘[30]、草莓[24]的樣品中總酚含量升高的趨勢不符,這可能和前處理方式有一定關系,總酚含量升高的報道多為前處理溫度較低或者直接打漿發酵不進行滅酶或者滅菌處理,細胞結構沒有完全破壞,可溶性的酚類物質溶出不徹底,因此在乳酸菌的減緩總酚含量降低的同時不斷溶出,導致總酚含量升高。也有研究指出,發酵過程中果蔬的不同會導致發酵過程中酚類含量的差異[24]。

2.6 不同乳酸菌發酵對西梅漿抗氧化活性的影響

由圖7可知,4個發酵組在96 h內DPPH自由基清除能力整體呈下降趨勢,在發酵終點(96 h),4個發酵組的DPPH自由基清除能力均高于對照組,其中嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌發酵組DPPH自由基清除能力仍處于較高的水平。保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌分別在0～24 h和24～48 h內DPPH自由基清除率近似等同,嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌發酵組分別在72和24 h時DPPH自由基清除率有上升的趨勢。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

如圖8所示,ABTS陽離子自由基清除率整體趨勢與DPPH自由基清除能力近似,整體呈下降趨勢,對照組ABTS陽離子自由基清除率下降幅度較DPPH自由基下降幅度更加顯著,在24 h內除瑞士乳桿菌發酵組外,ABTS陽離子自由基清除率僅有輕微下降。在發酵終點(96 h),4個發酵組的ABTS陽離子自由基清除率顯著高于對照組,其中嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌發酵組的ABTS陽離子自由基清除率相對較高(70.0%,72.9%)。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

如圖9所示,發酵組與未發酵組的Fe3+還原能力整體上差異不顯著(P>0.05),說明西梅漿在發酵過程中對于Fe3+還原能力無顯著影響,此結果與錢籽霖[31]的研究結果相似。

1-保加利亞乳桿菌;2-嗜熱鏈球菌;3-植物乳桿菌;4-瑞士乳桿菌

結合圖6,總酚含量在96 h內持續下降,說明總酚含量對DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力有一定影響,根據KWAK等[32]的研究,酚類物質的化合物可作為還原劑,是自由基的清除劑和單線態氧的猝滅劑,多酚類物質在乳酸菌發酵的過程中可以提高具有質子供體特性的多酚類化合物的有效性,在以西梅漿為基質的發酵體系中,抗氧化能力與酚類物質的含量呈正相關,但抗氧化能力不完全由酚類物質的含量決定,抗氧化能力可能與乳酸菌生長代謝過程中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽酶等抗氧化酶的產出也有一定關系[33]。

2.7 不同乳酸菌發酵西梅漿過程中各指標的相關性分析

利用 SPSS 23.0分別對4個發酵組的部分指標進行相關性分析(表1),可見4個發酵組的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率均與總酚含量呈極顯著相關(P<0.01),說明總酚含量對抗氧化活性的影響較大。4個發酵組的△a*、總糖、總酚、pH和抗氧化活性均有一定相關性,說明4株乳酸菌發酵時各指標存在較大的相關性及連鎖性,其中花色苷有一定清除自由基的作用,初始較高的糖濃度對花色苷有一定的保護作用,因此抗氧化活性的改變可能是酚類物質含量、花色苷的含量及菌種自身產生的抗氧化物質綜合作用的結果,pH值的降低和總酸含量的增加使體系環境偏酸,低pH值的環境使花色苷結構改變,△a*增加,體現的顏色偏紅。

表1 不同乳酸菌在發酵西梅漿過程中各指標與抗氧化活性的相關性分析

綜合上述,在西梅漿乳酸菌發酵過程中抗氧化能力由體系的綜合環境決定；體系的顏色更多受環境pH值的影響。

3 結論

本研究以“女神”西梅為發酵基質,以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和瑞士乳桿菌在液體培養基的生長曲線為參考,研究了4種乳酸菌在發酵西梅漿過程中基本品質的變化及抗氧化活性的變化情況。結果顯示,4株菌的產酸性能,對碳源的代謝能力與抗氧化能力均有所不同,植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵西梅漿過程中有相對較強的抗氧化能力,植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌在發酵西梅漿的過程中,產酸能力較強,可使體系pH值降至較低的水平,使體系的顏色偏紅。通過發酵,4個發酵組在發酵過程中DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率呈下降趨勢,相比于對照組仍可保持在較高的水平；乳酸菌發酵對Fe3+還原能力影響較小。

綜上所述,乳酸菌發酵可降低西梅漿體系的pH值,產出酸性物質,分解利用碳源,提升西梅漿的色澤,輔助減緩活性物質的降低,輔助維持抗氧化活性,該研究結果可為西梅等李屬植物的發酵提供依據,以期更好地將發酵技術應用到西梅產業。