全集成離心式微流控農殘檢測芯片研制

王曉東,喬奇偉*,宋志謙,李英利,李艷秋

1(常州工程職業技術學院 化工與制藥工程學院,江蘇 常州,213164) 2(常州市微流控芯片技術及裝備重點實驗室,江蘇 常州,213164)

離心式圓盤狀微流控芯片以離心力驅動液體流動,具有集成度高、通量大、易操作等特點,在食品安全快速檢測[1-2]、臨床診斷[3-4]等領域得到了廣泛應用。但通常待測樣品的前處理需要借助額外的設備[5-6],在芯片外部完成后再將檢測液體轉移至芯片中,大大降低了檢測系統的集成度,因此在芯片內部儲存微量液體試劑并完成樣本前處理是微流控分析技術目前面臨的挑戰之一[7-8]。已有文獻報道采用玻璃[9]和鋁基復合薄膜[10]的液囊集成到芯片中,但玻璃液囊加工難度大、成本高,復合材料液囊的封裝及液體釋放條件要求苛刻。

基于農藥殘留對健康的危害性[11-12]和農殘速測的緊迫性[13-14],微流控技術用于農殘快速檢測已見報道[15],但樣品的前處理仍需在農殘提取儀上完成,不利于檢測效率的提高。本研究采用透明聚乙烯(polyethylene,PE)膜制備微型液囊儲存液體試劑,并將其集成于芯片中,與預先固化反應試劑構成全集成微流控圓盤芯片,用于農藥殘留的快速檢測。通過拇指按壓擠破液囊的方式完成液體在線釋放,實現從樣品提取到最終檢測的全集成和自動化操作,省去常規方法中必需的農殘提取儀；結合實驗室自制的便攜式離心檢測系統,可以實現對果蔬類產品農藥殘留的快速、大規模篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)板材、雙面膠、PE、力致黏性膜,杭州九洋生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶(500 U/mg)、碘化硫代乙酰膽堿、5,5-二硫二硝基苯甲酸,國藥集團化學試劑有限公司；克百威標準品,上海市農藥研究所；pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液,中國計量科學院；小白菜,當地超市。

1.2 儀器與設備

Spirit LCD-30TI型激光精密切割機,廣州里程科技發展有限公司；CoolSafe55型冷凍干燥機,香港藥化科技公司；FR-400封口機,上海易諾包裝材料有限公司；GL124型分析天平,德國賽多利斯；Master-S15超純水系統,上海和泰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 芯片的設計與制備

離心式微流控芯片由3層組成,直徑80 mm,底層為厚度0.3 mm的空白PMMA基片,中間層為厚度3 mm的PMMA通道層,蓋板層為厚度0.1 mm的力致黏性膜。如圖1所示,每個單元包含：液囊池、樣品提取池、酶抑制反應池、顯色檢測池、廢液池、通氣孔及連接通道。其中液囊池存放裝有農殘提取液的液囊,樣品提取池用于樣品振蕩洗脫,酶抑制反應池和顯色檢測池通過冷凍干燥方法分別固定膽堿酯酶和檢測試劑[16]。制備芯片時將芯片結構圖輸入激光切割機軟件,選擇合適的激光功率和掃描速度,獲得帶有各種結構單元PMMA圓形盤片；雙面膠黏合空白底板和中間層,力致黏性膜作為蓋板層將其密封制得最終芯片。

a-立體結構；b-平面圖1-液囊池；2-樣品提取池；3-酶抑制反應池；4-檢測池；5-廢液池和通氣孔；6-液囊

1.3.2 檢測流程及原理

稱取0.2 g樣本碎片放入樣品提取池,力致黏性膜封裝后將芯片放置在實驗室搭建的檢測儀中,拇指擠壓液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊發生形變并破碎,完成液體釋放；檢測儀按設定轉速帶動芯片旋轉,離心力驅動提取液進入樣品池與待測樣品混合后,芯片順時針、逆時針周期性往復旋轉,以達到振蕩提取菜葉表面殘留農藥的目的；之后芯片順時針離心驅動提取液依次進入酶抑制反應池和檢測池,進行混合、生化和顯色反應,最后測量溶液在波長410 nm處吸光度變化值并計算農殘抑制率[17-18]。芯片上液體的流動狀態如圖2所示。

a-存儲；b-提取；c-反應；d-檢測

1.3.3 實驗平臺搭建

實驗室搭建了臺桌面型檢測系統,包含控溫、離心、光學檢測和數據處理模塊,該系統可以保持芯片所處的腔室恒溫37 ℃,離心轉速100～5 000 r/min,檢測芯片反應池內液體的吸光度值并計算農殘抑制率。

2 結果與分析

2.1 芯片的結構設計

芯片主要由四級串聯反應池構成,從圓心開始依次為液囊池、樣品提取池、酶抑制反應池、顯色檢測池。液囊池存放體積1 mL的農殘提取液囊；樣品提取池容積為3 mL,較大的體積利于固、液樣品在其中振蕩混合提取；酶抑制反應池、檢測池體積均為1 mL。液囊池與提取池通過短粗通道相連,便于液體在外力的作用下快速流入；剩余反應池的連接為細長通道,液體的流動通過離心力驅動完成,其中流體從提取池至酶抑制反應池離心轉速為1 500 r/min,從酶抑制反應池至檢測池轉速為2 000 r/min；廢液池200 μL,收集過量的反應液；排氣孔保持盤片內部壓力與外界大氣壓一致。

2.2 液體試劑的集成與釋放

以厚度0.02 mm的PE膜為液囊材料,首先熱壓制成一端開口的PE塑料袋,精密注入1 mL的磷酸緩沖液,熱壓密封制成液囊,放入微流控芯片液囊池中。如圖3所示,使用時拇指擠壓液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊發生形變并破碎,完成液體釋放,撤去外力后力致黏性薄膜迅速恢復原形貌,該薄膜在液體釋放時保證提取池的密封性,避免可能的外界接觸污染。PE液囊長期存儲實驗(25 ℃,60 d)顯示它的質量變化小于1%。結果表明采用本工作方法可實現液體試劑在微流控芯片中的簡易、長期封裝存儲。

a-液體試劑的集成；b-液體試劑的釋放

2.3 芯片中酶抑制反應動力學考察

常規速測法中酶抑制反應需在37 ℃恒溫反應10～15 min。本研究將0.1 mg/L克百威標準液加入芯片中,37 ℃恒溫條件下考察芯片中酶抑制反應動力學,結果顯示反應時間超過60 s后農殘抑制率不再變化,因此取1 min作為芯片中酶抑制反應時間。

2.4 農藥標樣檢測及檢出限

配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 mg/L的克百威標準液,按1.3.2方法檢測,結果見圖4。Origin軟件擬合抑制率-農藥濃度曲線,得出本方法對克百威農藥的檢出限為0.01 mg/L,低于GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有機磷與氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測要求的檢出限0.05 mg/L。

圖4 微流控芯片中克百威農藥標樣檢測結果

2.5 芯片中樣品提取時間的確定

針對微反應體系,將噴灑農藥的小白菜樣品0.2 g 放入樣品提取池,考察農殘抑制率隨樣品提取時間的變化趨勢。如圖5所示,抑制率隨提取時間的延長而增大,2 min后達到69%并保持穩定,本研究采用2 min作為芯片中樣品提取時間,與常規速測方法的提取時間保持一致。

圖5 芯片中農殘抑制率隨樣品提取時間的變化

2.6 加標回收率測定

表1列出了加標回收結果,回收率在95.0%～101.2%,相對標準偏差在2.1%～4.9%,表明該方法的準確度和重復性較好。

表1 加標檢測結果

2.7 方法對比

本研究提出的全集成離心式微流控農殘檢測芯片,相較傳統速測方法,首次將樣品前處理單元集成在芯片上,省去常規方法中的農殘提取儀,簡化了人工操作步驟,提高檢測效率,在芯片上實現從樣品提取至檢測的自動化操作,檢測結果的準確性滿足大批量樣品篩查需求。

3 結論與討論

基于微流控技術和酶抑制法的原理,本工作研制了一種全集成離心式圓盤微流控農殘檢測芯片,將液體生化試劑集成于離心式農殘速測芯片中,以氨基甲酸酯類農藥克百威為對象,其檢出限達到0.01 mg/L,符合現有國標速測儀檢出限標準。該檢測方法的優勢在于：(1)芯片集成前處理單元,提高了檢測效率；(2)無需樣品前處理設備,降低了檢測系統成本；(3)采用PE膜加工微型液囊,成本極低,適于大批量生產；(4)在微流控芯片中實現了從樣品提取到檢測的全自動流程,同時檢測結果準確性滿足國標需求。