四環素和砷對斑馬魚的聯合毒性及機制

李 歡,張靜麗,張詩雨,石明浩,謝 年,周柔靜,劉 蘇 (中國藥科大學工學院環境科學教研室,江蘇 南京 211198)

近年來抗生素被廣泛應用于疾病防治、農業生產、畜牧及水產養殖等領域[1],在使用的過程中,大部分抗生素被生物體排出體外,造成了其在環境中的大量積累.其中,四環素類(TCs)抗生素因成本低、抗菌譜廣而成為動物醫療中應用最廣泛的抗生素之一[2].盡管環境水體中 TCs的檢出濃度很低,但由于其在養殖業和畜牧業中被長期頻繁使用,殘留在環境中的 TCs總量大,對水生生態系統和人體健康構成極大的潛在威脅.研究表明,TCs及其代謝產物在水體中不僅會誘導生物產生抗性基因,還會對水生生物及人類產生潛在的毒性效應[3].其中,鹽酸四環素(TET)作為重要的 TCs之一,在環境中分布范圍廣、積累濃度高且不易降解,更應值得關注[4-5].TET能夠抑制或誘導還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性,并對魚類造成嚴重的 DNA損傷和免疫毒性[6].因此,TET在水生環境中的大量殘留帶來的潛在風險不容忽視.

在實際水環境中,TET往往與一種或多種毒害污染物共存,污染物共存的多樣性使得復合污染物的形態和毒性效應更為復雜[7].研究表明,TET可能會影響其他共暴露污染物的毒性效應.例如,TET與Cu聯合暴露時會發生絡合反應,降低 Cu的生物可利用度,進而顯著降低Cu對斑馬魚胚胎的發育毒性,表現出拮抗作用[1].TET和納米二氧化鈦(TiO2-NPs)聯合暴露時會增加 TiO2-NPs與大腸桿菌細胞接觸的面積,抑制細胞內外的物質運輸,導致細胞的代謝中斷或死亡,表現出明顯的協同作用[8].砷(As)是一種高毒的環境污染物,廣泛存在于世界各地的環境水體中[9].As的廣泛分布極大地增加了其與TET共存的可能性.As的過量攝入會顯著增加人群健康風險[10],氧化應激被認為是As對水生生物和哺乳動物產生毒性最重要的致毒機制[11].TET的重要致毒機制之一也是通過誘導氧化應激效應對斑馬魚等水生生物造成損傷[12].TET和As聯合暴露時是否會通過誘導氧化應激對水生生物產生更為嚴重的損傷尚不清楚.鑒于此,有必要對 TET和 As的聯合毒性進行評估.

由于斑馬魚具有發育快、繁殖力強和遺傳同源性高等優勢,是研究環境污染物毒性效應和環境風險的重要模式物種[13],在污染物的聯合毒性研究中也被廣泛使用.因此,為探究 TET和 As聯合暴露下對水生生物的毒性效應,本文選用斑馬魚作為模式生物,結合組織病理學、基因表達、As的含量測定和腸道微生物群落結構的變化來評估TET和As的聯合毒性效應,旨在為TET和As的環境風險評價提供基礎數據.

1 材料和方法

1.1 實驗動物和暴露實驗設計

實驗使用4月齡、健康狀態良好的雄性斑馬魚,購于中國科學院水生生物研究所(武漢),使用容積為14L并配有LED燈和曝氣裝置的魚缸進行飼養,每缸飼養60條斑馬魚.養殖水選用經紫外燈照射、除氯 24h的自來水,水溫控制(26±0.5)℃,pH 值控制在7～8,明暗周期為 14h/10h.每天早晚投喂豐年蝦幼蟲(豐年蝦卵在海鹽水中曝氣孵化 24h后使用分離器過濾得到).馴化1周后,斑馬魚隨機分為4組,暴露方案見表 1.根據文獻調研,我國多地地表水和地下水中TET和As的檢測濃度已達到10～50μg/L[8]和10～100μg/L[10],結合早期對TET和As毒性評估時使用的暴露濃度[4,14],本實驗設置TET和As的暴露濃度分別為50和100μg/L.實驗中TET購于上海源葉生物科技有限公司.As(Ⅲ) (As(Ⅲ)ICP-MS標準液)購于上海安譜實驗科技股份有限公司.在實驗過程中,每天更換1/3左右養殖水.暴露21d后,對斑馬魚進行冰凍處死,使用直尺和分析天平分別記錄斑馬魚的體長和體重.隨后對斑馬魚進行解剖,采集腸道、肝臟和腸內容物樣品.剪取部分腸道和肝臟放入提前裝有1mL福爾馬林(4%甲醛)固定液(西隴科學股份有限公司)的EP管中.將剩余腸道、肝臟和腸道內容物放置于凍存管內使用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存用于后續分析.

表1 實驗暴露方案Table 1 Exposure strategy used in this study

1.2 組織病理學檢測

將斑馬魚腸道和肝臟組織在 10%福爾馬林緩沖液中固定24h,用70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水,將脫水后的組織先后浸漬于無水乙醇、二甲苯混合液及純二甲苯中進行透明處理,隨后經石蠟包埋,垂直切成4μm切片黏附于載玻片上烘干備用.切片在著色前用二甲苯脫蠟,然后經乙醇溶液水化處理.使用蘇木精-曙紅(HE)染色,在100、200和400倍光學顯微鏡下觀察和拍照,記錄不同暴露組斑馬魚的組織病理學變化.

1.3 RNA的提取及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

斑馬魚腸道和肝臟組織樣本的 RNA提取使用RNA 提取試劑盒(Takara,日本)進行,利用超微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000,美國)檢測總RNA的純度和濃度,以OD260/OD280作為RNA純度的指標.對RNA進行逆轉錄合成cDNA,逆轉錄試劑盒為 PrimeScriptRT reagent kit(TaKaRa,日本).以cDNA為模板進行RT-qPCR反應.RT-qPCR擴增條件如下:95℃預變性30s;95℃變性10s,60℃退火30s,循環反應 40次;循環完成后,將溫度升至 95℃,持續15s,然后升至60℃,持續1min,最后加熱至95℃,以獲得聚合酶鏈式反應產物的溶解曲線.以 β-action作為內參,使用 2-ΔΔCt方法進行數據的相對定量分析,比較各組目的基因表達的差異.目的基因與內參引物序列如表2所示.

表2 目標基因的qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence of target gene

1.4 16S rRNA測序及生物信息學分析

每組中隨機選取6條斑馬魚的腸道內容物作為1個樣本.采用DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit,MP Biomedicals, USA)提取樣本中的 DNA.使用PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN, Germany)對得到的 PCR產物進行純化.PCR 擴增體系為:2*taq PCR mix:25μL Primer F(10μmol/L):1μL; Primer R(10μmol/L):1μL; gDNA:2～10μL; ddH2O:補足 50μL 體系 PCR 擴增程序:1、95℃ 5min; 2、94℃ 1min; 3、57℃ 45s; 4、72℃ 1min,2～4步34個循環; 5、72 ℃ 10min; 6、16℃ 5min.選取 16S V3-4區域進行擴增,該區域引物序列為:341F:CCTAYGGGRBGCASCAG; 806R:GGACTACNNGGGTATCTAAT.將純化后的PCR產物在Ion S5TMXL高通量測序平臺上測序.對原始數據進行拼接、過濾和處理以除去低質量的干擾數據.將預處理后的測序數據利用 QIIME軟件作進一步的物種分類,對所有樣品測序數據的Effective Tags以97%的相似性將序列聚類成為OTU,并對OTU的代表序列進行物種注釋.

1.5 電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析

將液氮速凍后的腸道和肝臟新鮮樣品放入凍干機中冷凍干燥.稱量約 25mg的凍干樣本,并加入2mL36%的硝酸與2mL 40%的雙氧水.經加熱消解、趕酸和超純水稀釋定容至 1mL.組織提取液過0.22μm 濾膜,利用 ICP-MS (Agilent 7700,安捷倫科技有限公司)在KED模式下測定As含量.

1.6 數據分析

運用GraphPad prism 7.0軟件對實驗所得數據進行統計分析,對照組和實驗組之間的差異采用單因素方差分析.實驗所有數據以(平均值±標準偏差)來表示.所有的統計結果中以P<0.05視為具有顯著性差異.

2 結果分析

2.1 TET或/和As對斑馬魚表型特征的影響

如圖1所示,與對照組相比,TET或As的單獨暴露未導致明顯的體長變化.而TET和As聯合暴露處理導致斑馬魚的體長顯著地降低(P<0.05).此外,與TET或As單獨暴露時相比,TET和As聯合暴露時體長的減小也存在顯著性差異(P<0.05).與對照組相比,所有實驗組的體重均無顯著性變化(P>0.05),而與TET組相比,TET和As的聯合暴露顯著地改變了斑馬魚的體重(P<0.05).結果表明TET和As的聯合暴露顯著加重了其單獨暴露時對斑馬魚體長和體重的影響.

圖1 TET或/和As的暴露對斑馬魚體長和體重的影響Fig.1 Effects of TET or/and As exposure on body length and weight of zebrafish

2.2 TET或/和 As對腸道和肝臟組織病理學的 影響

利用HE染色觀察腸道和肝臟的組織病理學變化.如圖2所示,在對照組中腸絨毛整體形態比較完整,腸上皮細胞排列規則整齊,無明顯的損傷.在TET組發現了輕微的腸粘膜上皮細胞脫落現象(藍色圓圈).As組出現了輕微的腸壁破裂的現象(黑色箭頭).TET+As組出現了明顯的炎性細胞浸潤(綠色箭頭)并伴有出血的現象(橙色圓圈).肝臟的鏡檢結果與腸道相似,如圖3所示,對照組的肝臟排列規則整齊,未見明顯的病變現象.而在 TET組中,觀察到了少量炎性細胞浸潤的現象(綠色箭頭).在As組中出現了肝索紊亂、竇間隙擴大的現象(紅色箭頭).在TET和As聯合暴露組中觀察到擴張的肝血竇中浸潤大量炎性細胞(綠色箭頭),局部血管周圍出現出血的現象(橙色圓圈).組織病理學結果表明,TET和As的聯合暴露顯著加重了其單獨暴露時對腸道和肝臟組織的損傷.

圖2 斑馬魚腸道HE染色切片Fig.2 HE staining section of zebrafish intestine

圖3 斑馬魚肝臟HE染色切片Fig.3 HE staining section of zebrafish liver

2.3 TET或/和 As對腸道和肝臟重要功能基因表達的影響

腸道的功能性基因表達結果如圖 4(a)所示.與對照組相比,腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平在TET組和 As組均沒有顯著變化,而在 TET+As組TNF-α的表達水平顯著地上調 3.05±0.55倍(P<0.05).與TET和As的單獨暴露相對比,TET和As的聯合暴露也明顯地增加了 TNF-α的表達水平(P<0.05).P-糖蛋白(P-gp)基因的表達在TET組和As組均沒有顯著差異,而在TET和As聯合暴露組中顯著地下調,與As組相比,TET和As聯合暴露組中P-gp的表達也顯著地下調.與TET和As的單獨暴露相對比,谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和原癌基因(C-jun)的表達在 TET+As組中均顯著上調.緊密連接蛋白(Claudin-1, Occludin)基因的表達在所有實驗組中均無顯著性差異(P>0.05).腸道基因檢測的結果表明TET和As的聯合暴露會顯著地加重其單獨暴露時對腸道造成的損傷且這種損傷與腸道通透性的相關性不大.

圖4 斑馬魚腸道和肝臟功能基因的表達Fig.4 Expression of intestinal and liver functional genes in zebrafish

肝臟的功能基因表達結果如圖 4(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中的TNF-α的表達水平顯著上調(P<0.05),分別上調了(1.42±0.25)和(2.45±0.45)倍.與 TET和 As的單獨暴露相對比,TET和As的聯合暴露顯著地增加了 TNF-α的表達(P<0.05).過氧化氫酶(CAT)和GPx的表達在TET組均沒有顯著性變化,而TET+As組中CAT和GPx基因的表達顯著上調.此外,C-jun和腫瘤抑制基因(p53)的表達水平在 TET+As組中也顯著增加(P<0.05).與TET和As的單獨暴露相對比,TET和As的聯合暴露明顯地增加了CAT、GPx、C-jun和p53的表達水平(P<0.05).MRP2(多藥耐藥相關蛋白-2)基因的表達在TET和TET+As組中均顯著地下調,與As組相比, TET和As的聯合暴露顯著地下調了 MRP2的表達水平.上述結果表明 TET和 As的聯合暴露也會顯著增加TET和As單獨暴露時對斑馬魚肝臟的損傷.

2.4 TET對As在腸道和肝臟分布的影響

利用ICP-MS檢測As在斑馬魚腸道和肝臟的分布.腸道中 As的濃度如圖 5(a)所示,與對照組相比,As和 TET+As組中 As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別達到(461.68±20.35ng/g)和(704.15±24.50ng/g).與TET組和As組相比,TET和As的聯合暴露顯著地增加了As在斑馬魚腸道中的積累.肝臟中 As的濃度如圖 5(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別為(322.39±22.28),(458.35±24.25)ng/g.此外,與 TET和As單獨暴露時相比,TET與As的聯合暴露也顯著性增加了As的積累(P<0.05).對As在腸道和肝臟化學檢測的結果表明TET和As的共暴露增加了腸道和肝臟中As的積累.

圖5 砷在腸道和肝臟中的濃度Fig.5 The concentration of As in intestine and liver

2.5 TET或/和As對腸道微生物群落的影響

基于 OTU 水平,對樣本進行主成分分析(PCA)來確定不同暴露組間微生物群落的分布特征,其中每一個點表示一個斑馬魚腸道內容物樣本,相同顏色的點表示來自同一個處理組,兩點之間的距離越近表明兩樣品間的群落構成差異越小.如圖 6(a)所示,TET組、As組和對照組相比均有明顯的區分,而TET+As組與對照組差異性不大,這表明TET和As的單獨暴露對腸道微生物群落結構具有顯著地影響,但TET和As的聯合暴露對腸道微生物群落的結構影響較小.如圖6(b)所示,與對照組相比,TET和As的單獨暴露分別引起5825和3869種不同微生物發生變化,而TET和As聯合暴露僅引起623種不同的微生物發生變化.該結果也表明TET或As的單獨暴露顯著地擾亂了腸道微生物群落結構,而TET和As的聯合暴露對腸道微生物群落的影響較小.為觀察斑馬魚腸道微生物在門(phylum)水平上的相對豐度,選取在門水平上的豐度信息,生成相對豐度堆積圖.結果如圖7所示,可以發現變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)是斑馬魚腸道中的絕對優勢菌.與對照組相比,TET的暴露導致變形菌門的豐度從 38%上調至 87%,As的暴露導致放線菌門的豐度從 15%上調至 52%,TET和As的聯合暴露與對照組無明顯差異.經典聚類分析(圖7a)的結果也表明TET組和As組與對照組相比有明顯的區別,此外,TET組與對照組相比相距較遠,這表明 TET是影響腸道微生物群落變化的主要因素.

圖6 斑馬魚腸道微生物的主坐標分析和韋恩圖Fig.6 Principal coordinate analysis and venn diagram of zebrafish intestinal microorganism

圖7 斑馬魚腸道微生物經典聚類分析和相對豐度Fig.7 Classical cluster analysis and relative abundance of intestinal microorganism

3 討論

TET和As在水環境中的廣泛分布對環境和人體健康存在嚴重風險.盡管TET和As各自的毒性效應已有不少文獻報道,但關于TET和As同時暴露的聯合毒性效應及其機制的研究鮮有報道.本研究以斑馬魚為模式生物,研究了 50μg/L TET和 100μg/L As的單一暴露和聯合暴露對斑馬魚腸道和肝臟的影響.結果表明50μg/L TET的暴露能夠輕微地導致斑馬魚腸絨毛結構破壞,肝臟炎性細胞浸潤.100μg/L As的暴露可引起斑馬魚腸壁破裂,肝索紊亂和竇間隙擴大.此外TET和As的單一暴露均能夠誘導斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷并誘導腸道微生物群落發生顯著的變化.與TET和As的單一暴露相比,TET和 As的聯合暴露能夠顯著增加氧化應激、炎癥因子和凋亡因子相關基因的表達,加重腸粘膜的纖毛損傷和出血,誘導肝臟血管周圍出血和炎性細胞浸潤.此外還發現兩者的聯合暴露顯著增加了 As在腸道和肝臟的累積,這可能是造成 TET和As對斑馬魚腸道和肝臟的協同毒性的主要原因.

TET進入水環境導致的生態毒性效應已經引起人們的高度關注.據報道,20μg/L TET能夠造成斑馬魚胚胎或幼蟲體長縮短、孵化延遲和卵黃囊面積增加等[13].100μg/L TET的暴露可造成腸道微生物群落結構紊亂,以及肝臟脂肪積累[15].本研究中也發現了相似的結論,50μg/L TET能夠顯著地增加斑馬魚腸道中變形菌門的豐度,并誘導肝臟組織出現少量炎性細胞(圖3,圖7).有研究認為,氧化應激是污染物導致動物體內誘發毒性和疾病發生的重要機制.在抗氧化防御系統中,CAT和SOD是抵抗ROS的第一道防線,SOD能夠催化 O2-轉變成 H2O2,最后在CAT或GPx的作用下轉變成H2O[16].GPx是一種重要的抗氧化酶,可作為環境污染物誘導氧化應激的生物標志物[17].本研究發現TET暴露能顯著增加腸道中GPx基因的表達,這可能由于TET的暴露誘導斑馬魚腸道產生過量的 ROS,激活氧化系統,從而使GPx表達上調.以上數據證實了TET對斑馬魚的生態毒性.

研究表明,As會在白粉魚的肝、腎和腸等臟器中積累,并對肝、腎和腸道造成病理學損傷[14].本研究證實100μg/L As的暴露能夠顯著誘導斑馬魚肝臟炎癥因子(TNF-α)的表達上調,破壞腸道上皮細胞進而造成組織病理損傷.As誘導生物毒性的潛在機制被認為與氧化應激有關[11].As可以誘導 ROS的增加,破壞蛋白質和 DNA或與構成細胞膜的脂肪發生化學反應,產生更具破壞性的脂質自由基,進而破壞細胞膜的完整性和功能[17].本研究表明 As的暴露能夠顯著上調斑馬魚肝臟中 GPx基因的表達,進一步證實了氧化應激在 As誘導斑馬魚毒性中的作用.

TET和As的共暴露進一步加劇了對斑馬魚毒性的復雜性.本研究發現,與 TET和 As的單一暴露相比,TET和As的聯合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟的毒性效應具有協同作用.As與環境污染物的協同效應在其他研究中也有報道.例如,As和阿特拉津都具有潛在的致畸性和遺傳毒性,并可引起斑馬魚胚胎的氧化應激,聯合暴露時形成毒性更強的中間代謝物,造成對斑馬魚的更高毒性[18].As和甲基化硒化合物聯合暴露時,能夠阻斷部分甲基化形式的解毒過程(如甲基化),引起氧化應激水平的提高,表現出明顯的協同毒性[19].本研究表明TET和As聯合暴露能夠明顯地增加氧化應激、炎癥因子和凋亡因子的表達,對斑馬魚的腸道和肝臟造成更嚴重的損傷.

As的毒性在TET和As的協同毒性中發揮著重要的作用.As的毒性效應與其形態有著密切聯系,通常認為 As(Ⅴ)的毒性遠遠低于 As(Ⅲ)[20-21].早期的研究表明腸道微生物群落的變化可能會導致 As的毒性發生改變.例如,某些腸道微生物能夠將 As(Ⅲ)主動代謝為As(Ⅴ),從而導致As的毒性發生改變[22].本研究發現TET和As暴露能夠明顯地影響斑馬魚腸道中變形菌門和放線菌門等優勢菌群的豐度,而TET和As的聯合暴露對腸道微生物群落結構影響不大,這個結果表明腸道微生物群落的變化并非是造成TET和As的協同毒性的原因.微生物群落的變化與環境污染物毒性效應的表征并非完全一致,這一現象在文獻中曾被報道,如口服納米銀(AgNPs)誘導小鼠腸道和肝臟嚴重的炎癥和氧化損傷,而小鼠腸道微生物群的組成、結構和多樣性并未發生明顯變化[23].推測這可能與PCA分析方法有關,首先PCA是建立在微生物DNA提取的基礎上進行分析,據文獻報道目前腸道微生物提取效率有限,部分微生物并未被提取到[24],其次,PCA的分析是研究腸道菌群的整體差異,忽略了特異性[25],本研究中腸道和肝臟具體毒性指標屬于特異性指標,相對于整體微生物群落的變化指標屬于不同的體系,這可能是導致TET和As聯合暴露下微生物菌群的變化與毒性效應表征不一致的原因.另外,斑馬魚腸道微生物優勢菌群主要有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門等,當起毒性作用的屬于少部分微生物時,由于其變化在整個微生物群中所占的比例很小,導致其在 PCA中沒有體現出來時,可能也會導致微生物的結果和聯合毒性的結果不同[26].據以往文獻報道,生物有效性的變化對污染物的毒性也有顯著的影響,如納米二氧化鈦(TiO2)的加入能夠顯著增強斑馬魚幼魚對鉛的生物累積和吸收,并增強鉛對中樞神經系統的發育毒性,導致斑馬魚幼魚甲狀腺內分泌和神經系統的紊亂[27].Cu會增加氟喹諾酮類化合物(FQS)在斑馬魚腸道和肝臟中的積累,進而造成嚴重的損傷[28].本研究中TET的存在顯著地增加了As在腸道和肝臟的積累,進而誘導對腸道和肝臟更嚴重的損傷.腸道通透性對污染物在生物體內的積累有顯著的影響.正常的腸道黏膜屏障能夠有效阻止污染物進入機體,保護機體不受外界的侵害[29].然而據報道腸道通透性的破壞會顯著地增加污染物在腸道和肝臟中的積累,進而對腸道和肝臟造成一定的損傷[30].Occludin是一種腸上皮緊密連接蛋白,在腸屏障中發揮重要作用,它對于維持腸粘膜通透性至關重要[31].本研究發現 Occludin基因的表達水平在各實驗組中均無顯著性差異,這表明TET和As的協同毒性可能與腸道通透性的變化無關.P-gp是位于小腸粘膜上皮細胞的膜轉運蛋白,能夠將進入細胞的外源化學物以主動轉運的方式泵出細胞外,對進入細胞內的物質生物利用度有顯著影響[32].前人的研究表明mdr1a/1b雙基因敲除的小鼠由于P-gp蛋白的活性受到抑制,會導致As的排出受到限制,組織中的As蓄積增加,顯著地加劇了As的急性毒性[33].本研究發現TET和As的聯合暴露能夠明顯下調P-gp基因在腸道的表達.基于以上分析,推測 TET和 As的聯合暴露導致斑馬魚腸道中 P-gp基因的活性受到抑制,使As的外排量減少,增加了As在腸道的積累,部分As通過血液循環到達肝臟,對腸道和肝臟造成嚴重的損傷.

4 結論

4.1 TET和As的單一暴露可導致斑馬魚腸絨毛結構破壞,肝臟炎性細胞浸潤,并誘導斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷.

4.2 與TET和As的單一暴露相比,TET和As的聯合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟均產生明顯的協同毒性,這可能與P-gp基因被抑制介導的As蓄積增加有關.