基于網絡藥理學探討龜鹿二仙膠對放化療后骨髓抑制的機制研究

王鑫虹

摘要：基于網絡藥理學探討龜鹿二仙膠（Gui-Lu-Er-Xian-Jiao，?GLEXJ）治療腫瘤放化療后骨髓抑制（bone?marrow?suppression，BMS）的作用機制。運用TCMSP、TCMID數據庫獲取活性成分和作用靶點，在GeneCard、DisGeNET等數據庫檢索疾病靶點，成分靶點與疾病靶點映射后利用Cytoscape軟件和STRING數據庫構建GLEXJ“成分-靶點-疾病”調控網絡與PPI網絡，metescape數據庫進行GO和KEGG富集分析。篩選得GLEXJ?86個活性成分，度值較高的化合物有槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等，其作用于ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1等89個關鍵靶點，這些靶點主要富集在MAPK、TNF、PI3K-Akt等與BMS相關的通路上。GLEXJ治療BMS的作用體現了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，其機制可能與調控細胞增殖、調節細胞周期、調控氧化應激等多方面相關，本研究為后續研究提供一些思路和借鑒。

關鍵詞：骨髓抑制;網絡藥理學;龜鹿二仙膠;作用機制;

近年來我國腫瘤的發病率不斷攀升，而治療手段中的多數抗癌藥物和放、化療在滅殺腫瘤細胞同時會讓正常骨髓細胞受損，骨髓抑制是放、化療后常見的限制性毒性反應，不但令患者身體狀況惡化，甚至導致嚴重感染而增加死亡風險。中藥作為輔助用藥，以其療效確切、副作用小等特點，在減緩BMS方面表現出良好的前景。

龜鹿二仙膠（GLEXJ）由龜板、鹿角膠、人參和枸杞組成，具有補益肝腎、填精益髓、助陽益氣之功。有研究表明，GLEXJ能促進骨髓基質干細胞增殖并誘導其向成骨細胞分化[1];能減少細胞周期的阻滯，逆轉化療所致的骨髓造血干細胞（HSCs）衰老[2]。然而GLEXJ成分較為復雜，其治療BMS的物質基礎和作用機制尚未完全闡明。本研究將采用網絡藥理學方法初步闡釋GLEXJ治療BMS可能的作用機制，同時為臨床更好地診治BMS提供了一些參考與新思路。

1?材料與方法

1.1?成分檢索及篩選靶點

運用TCMSP、TCMID數據庫檢索鹿角膠、龜板、人參、枸杞子的化學成分及作用靶點，根據口服生物利用度（0B）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18篩選各活性成分。利用PubChem數據庫得成分的SDF格式文件，導入至Swiss?Target?Prediction平臺，進行反向藥效團匹配預測化合物靶點，并設定“Probability>0.6”[6]的靶點作為關聯性較高的潛在靶點，經規范、去重后得相應的靶點。

1.2?疾病靶點的獲取及分子網絡的構建分析

以“Bone?Marrow?Suppression”為關鍵詞，?在DisGeNET、DiGSeE、GeneCards數據庫獲得BMS相關基因，剔除重復靶點，獲取BMS相關的唯一靶點基因。利用Venny軟件獲取GLEXJ-BMS的交集靶點，通過Cytoscape軟件構建GLEXJ“活性成分-靶點-疾病”網絡，利用Network?analyzer功能對網絡中的拓撲屬性進行分析。利用String數據庫和Cytoscape軟件構建PPI網絡，根據各個節點的自由度，介度中心性和接近中心性等參數值對獲得的映射網絡進行篩選，獲取得分前十的核心蛋白。

1.3?GO功能富集及KEGG通路富集分析

利用metascape數據庫對核心靶點參與的生物學過程、信號通路進行分析，設置P≤0.01，獲得GO功能及KEGG信號通路富集分析結果，利用?R語言繪制富集分析圖。

2?結果

2.1?化合物成分的獲取及篩選

通過TCMSP和TCMID數據庫共獲GLEXJ藥物成分400個。經OB≥30%、DL≥0.18篩選后得有效成分共86個，其中人參22個，枸杞子45個，龜板20個，鹿角膠2個。利用TCMSP和Swiss?Target?Prediction平臺共獲取647個蛋白靶點，其中人參靶點為256個，枸杞子靶點為364個，龜板靶點為27個，鹿角膠靶點為0個，當中枸杞子成分槲皮素（quercetin）擁有154個潛在靶點。

2.2?疾病靶點的篩選及分子網絡構建與分析

在GeneCards、DisGeNET、DigSee數據庫得BMS相關靶點分別為6438個、39個、10個，3個數據庫的結果合并、去重后得到6?448個靶點基因。將647個成分靶點與6448個BMS靶點進行映射，得共同靶點89個，借助Cytoscape軟件構建“活性成分-靶點-疾病網絡”，其中度值最大的5個成分為槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃豆黃素。將89個交集靶點導入至STRING數據庫，并利用?Cytoscape軟件進行分析，從而獲取PPI網絡圖，圖中節點表示蛋白，邊表示功能相關性，度值大小決定節點面積大小，節點面積越大表示蛋白在網絡中所起的作用越大。篩選相關網絡拓撲參數，其中居Degree值前十位的靶點依次為：ESR1、RELA、FOS、MAPK8、EGFR、CCND1、NR3C1、NCOA2、PRKCA、APP，這10個靶點被認為是GLEXJ治療BMS的核心靶點。

2.3?GO功能分析及KEGG富集分析

將89個交集靶點應用metascape數據庫進行相關富集分析，設置P≤0.01，依據P值篩選排名前20的GO-BP與KEGG富集結果，繪制富集分析圖。共得到GO富集條目1541個，其中，生物過程條目1?372個，主要涉及調節細胞生長、細胞對激素刺激的反應等;分子功能條目104個，主要涉及轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合等;細胞成分條目65個，主要涉及膜筏、膜微區等。共得139個KEGG富集條目，其中前20條信號通路依據KEGG?BRITE層次分類，與疾病通路相關有16條，信號傳導相關通路3條，1條與細胞過程相關通路。提示GLEXJ能通過多種疾病通路、信號通路及代謝通路對BMS發揮作用。