耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌流行病學分析

陳燁 孫守棟 周芳美 楊雪靜

肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性條件性致病菌，可引起肺炎、神經系統感染、肝膿腫、皮膚軟組織感染、泌尿系感染及敗血癥等多種臨床感染［1］。碳青霉烯類抗生素是治療產超廣譜β-內酰胺酶腸桿菌科感染的首選藥物［2］，但隨著該類抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）逐漸在各個國家及地區流行［3-4］，成為臨床治療的難點。如同時攜帶毒力因子，則對臨床治療構成嚴重威脅［5］。肺炎克雷伯菌毒力因子主要分為脂多糖、莢膜、鐵攝取系統相關因子、外膜孔蛋白、尿囊素代謝相關基因等［5］，其中莢膜是重要的毒力因素，可促進菌株的黏附、抗吞噬、抗血清殺菌和遠處定植［6］。為進一步明確本地區CRKP菌株耐藥特點及其攜帶毒力因子的情況，作者對臨床分離的CRKP菌株進行耐藥表型及毒力因子檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2019年8月至2020年1月浙江中醫藥大學附屬第一醫院分離的CRKP菌株43株，剔除同一患者重復菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要試劑及儀器 細菌核酸提取盒、10×Ace Taq PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP mix、Ace Taq與DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；質譜儀（Bruker）、Vitek-2 Compact 全自動微生物分析系統（法國生物梅里埃公司）、PCR 儀（美國 Bio-Rad 公司）、電泳儀及紫外凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；擴增引物合成及PCR產物測序由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.3 菌株鑒定 挑取血平板上24 h培養的菌落，涂布細菌于靶板，經MALDI-TOF質譜儀鑒定確認，鑒定率需達到2.0以上。

1.4 藥敏試驗 采用Vitek-2 Compact微生物分析系統進行藥敏試驗，瓊脂稀釋法確認碳青霉烯類藥物敏感性，藥敏結果采用美國臨床和實驗室標準化協會（CLIS）推薦標準進行判斷。

1.5 高黏液表型檢測 用接種環挑取血平板待測菌株，挑起的黏液絲長度若≥5 mm，為黏液絲試驗陽性，重復≥3次確定為高黏液菌株。

1.6 毒力因子PCR擴增及序列分析 采用PCR檢測莢膜血清型K1、K2、K57、K5、K20、K54，毒力基因uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、peg-344、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB，Hcp和外膜孔蛋白Ompk35、Ompk36基因。陽性產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序，序列與GenBank數據庫比對。Hcp引物由Primer5軟件設計而成（Hcp-F：CCACATTCACCAGGAAACCC；Hcp-R：GCATCGGACAGCCAAAGG）。反應體系、反應條件及引物合成參照文獻［7-11］。

2 結果

2.1 科室及臨床來源分布 CRKP菌株來源及科室分布見表1、表2。

表1 CRKP標本分布

表2 CRKP科室分布

2.2 CRKP藥敏結果 43株菌對頭孢菌素、β-內酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類耐藥率最高，對氨曲南、環丙沙星、左旋氧氟沙星、復方新諾明、多西環素及米諾環素耐藥率均>90%，對替加環素及粘菌素耐藥率較低。見表3。

表3 CRKP耐藥性情況

2.3 高黏液及莢膜型檢測 黏液絲試驗顯示16.3%菌株為高黏液表型。發現1株K5莢膜陽性菌株，且為高黏液表型，未檢出其他莢膜血清型。

2.4 毒力基因檢測 18種毒力基因中uge、wabG、ycf、ureA、entB及fimH基因檢出率最高，均>90%，未檢測到iroB、alls、magA和wcaG基因。見表4。攜帶12種毒力基因菌株所占比例最高，均攜帶uge+wabG+fimH+rmpA+ycf+ureA+ybtA+iutA+entB+rmpA2+iucA+peg-344基因。見表5。

表4 CRKP毒力基因攜帶情況分析

表5 CRKP攜帶毒力基因種數分析

2.5 Hcp、Ompk35、Ompk36基因檢測 4.7%菌株缺失Hcp基因，9.3%菌株缺失外膜孔蛋白基因，2株缺失Ompk35、Ompk36和Hcp基因菌株未檢測到毒力基因。見圖1、圖2。

圖1 Hcp基因產物測序峰圖

圖2 Ompk36基因電泳圖

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起社區獲得性及院內感染的重要腸桿菌科細菌，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，CRKP不斷增多，耐藥性逐漸增強。中國細菌耐藥性監測報告顯示，2017、2018年肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為20.9%、24.0%和25.0%、26.3%，呈逐步上升趨勢［12-13］。CRKP對臨床常用抗生素耐藥率高，僅對粘菌素和替加環素顯示出較好的敏感性，產碳青霉烯酶是CRKP耐藥的主要機制之一，轉座子、質粒等遺傳元件傳播可使CRKP感染爆發流行。本資料結果顯示，CRKP對頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、單環內酰胺類、多肽類等均有不同程度耐藥，且多為ICU患者，預后不佳，病死率較高，給臨床抗感染治療帶來困難。

CRKP可通過鐵攝取系統毒力因子（aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、alls、kfuB）、黏附因子（fimH、mrkD）、莢膜因子（uge、wabG、ycf）、毒素因子（magA、rmpA、rmpA2、wcaG）、尿囊素調節因子（ureA）等增加黏附、侵襲、抗吞噬等能力。將aerobactin基因插入低毒力肺炎克雷伯菌可增強肺炎克雷伯菌毒力與侵襲性。李喜紅等［14］發現CRKP菌株aerobactin基因攜帶率較低，本資料中僅發現1株攜帶aerobactin基因菌株，與其結果相符。CANDAN等［15］發現>80% CRKP菌株含有黏附因子、鐵攝取系統毒力基因，本資料中>74% CRKP菌株攜帶uge、wabG、ycf、entB、ureA、fimH、ycf、ybtA、iucA、iutA、rmpA2基因，這些因子不僅可以增強黏附、侵襲力，且能夠表達自我保護成分，對菌株致病性具有重要意義。有報道稱rmpA、rmpA2、iroB、iucA及peg-344能夠作為高毒力肺炎克雷伯菌的鑒定指標，準確率>95%［16］，本資料未發現此類菌株，可能與肺炎克雷伯菌獲得高耐藥表型時丟失毒力因子以及高毒力肺炎克雷伯菌難以獲得耐藥質粒有關。

莢膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，可對抗中性粒細胞的吞噬作用，其中K1、K2、K57、K5、K20和K54莢膜型與人類的侵襲性感染密切相關。K1莢膜型易見于肝膿腫、菌血癥等，K1、K2及K5莢膜型致病性強，且與嚴重感染有關。耐碳青霉烯類高黏液肺炎克雷伯菌（CR-HMKP）會引起難以治愈的感染，報道稱高黏液菌株K抗原檢出率達85%［17］，本資料中，7株CR-HMKP菌株僅1株檢測到K5莢膜型，考慮可能存在其他莢膜型亞型或高耐藥表型減弱了莢膜型的表達；另外K5莢膜型CR-HMKP菌株攜帶10種毒力基因，且為ICU患者，糖尿病慢性病史，住院時間長，有多種抗生素使用及侵襲性操作史，治療效果不佳，應引起臨床高度重視。Hcp是VI型分泌系統（T6SS）核心組成部分，在細菌的致病性發揮重要作用，DU等［17］發現攜帶Ompk36基因的菌株毒力較強。本資料中Hcp、Ompk35和Ompk36基因陽性率高，同時Ompk35、Ompk36和Hcp基因缺失菌株未檢測到毒力基因，3種基因缺失是否影響菌株毒力基因攜帶需進一步探究。