21-羥化酶缺陷癥7例臨床特點及基因診斷分析

韓賓賓，鄭瑞芝，解一丹，袁慧娟

(河南大學人民醫院/河南省人民醫院 內分泌科，河南 鄭州 450003)

先天性腎上腺皮質增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是類固醇激素合成過程中某種酶缺陷，引起以皮質激素合成受損為特征的一組常染色體隱性遺傳性疾病。常見類型包括21-羥化酶、11β-羥化酶、17α-羥化酶等，其中以21-羥化酶缺陷癥(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)最為常見，占CAH的90%以上[1]。由于CAH臨床表型變異較大，基層臨床醫生對該病認識不足，易出現漏診或延誤診治，錯失治療良機，且隨患者年齡增長可誘發性發育、性心理、性行為等方面的諸多問題，造成其心理與行為偏差，嚴重影響生活質量。本研究回顧性分析于河南省人民醫院就診的7例21-OHD患者的臨床和CYP21A2基因突變特點，以期提高該病的診治水平。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性選取2017年11月至2020年6月于河南省人民醫院就診的7例21-OHD患者，其中染色體核型為46，XY 3例，46，XX 4例，年齡3 d～44歲。父母均非近親婚配，均無家族史。診斷參考《先天性腎上腺皮質增生癥21-羥化酶缺陷診治共識》診斷標準[2]，臨床均診斷為21-OHD，其中失鹽型(salt-wasters，SW)2例、單純男性化型(simple virilizing，SV)5例。本研究通過了河南省人民醫院醫學倫理委員會的審查(20170303)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1生化檢查及激素測定方法 全自動生化儀測定血電解質、血糖；血氣分析儀測定血氣；化學發光法測定黃體生成素(leuteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estrogen，E2)、睪酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、雄烯二酮(androstenedione，AND)、硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質醇(cortisol，COR)；放射免疫法測定17α-羥孕酮(17α-hydoxy progesterone，17α-OHP)、血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)等。

1.2.2影像學檢查 盆腔彩超、腎上腺CT、垂體磁共振成像、左手正位片等。

1.2.3基因檢測

1.2.3.1基因組DNA提取 收集患者外周全血標本(EDTA抗凝)備用，采用全血基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.3.2引物設計與合成 根據美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)中GenBank數據庫的CYP21A2基因DNA參考序列，并比較CYP21A1P基因DNA參考序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計擴增CYP21A2基因全部外顯子及旁側內含子區域(見表1)。

表1 CYP21A2基因10個外顯子的擴增引物序列

1.2.3.3PCR擴增與測序 引物各20 pmol，DNA模板0.2 μg，dNTP 10 nmol，MgCl225 nmol，Taq酶 2.5 U。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，重復35個循環，72 ℃延伸10 min。利用凝膠成像系統觀察條帶擴增，單一條帶者可進行Sanger測序，所有樣本均經雙向測序驗證。若檢測到基因突變位點，尚需進一步對受檢者父母行靶向變異檢測以尋找和明確變異來源。此實驗由鄭州大學鄭州普利萊醫學檢驗所協助完成。

1.2.3.4MLPA檢測與分析 采用荷蘭MRC-Holland公司的SALSA MLPA kit P050試劑盒按標準操作說明對部分患者及其父母的CYP21A2基因進行檢測。

1.2.3.5生物學信息分析 將所有測序結果與文獻報道和GenBank數據庫中已知的標準參考序列進行比對。

2 結果

2.1 臨床特征如表2所示，7例患者中，SW型2例(1男，1女)，SV型5例(2男，3女)，其中外生殖器異常占85.7%(6/7)，兒童期生長加速占71.4%(5/7)，皮膚色素沉著占71.4%(5/7)，多毛占57.1%(4/7)，乳房發育占42.9%(3/7)，陰毛早現占28.6%(2/7)。例1(核型為46，XX)生后即發現陰蒂肥大，無失鹽表現，查電解質正常，后因體質量不增復診，查高鉀、低鈉血癥，代謝性酸中毒，確診為SW型。另有2例女性患者(例4、例7)曾因陰蒂肥大似小陰莖樣，分別于4歲、20歲行“外陰整形術”。其中，例4有月經初潮，經期短，經量少，例7為原發性閉經。2例男性SV型患者(例5、例6)，均存在幼時生長過快，胡須、喉結過早顯現，聲音粗或低沉，皮膚粗糙，肌肉發達等男性化表現，但早年未引起重視，以婚后不育就診。

表2 7例21-OHD患者的臨床特征

2.2 實驗室檢查例1、例2血氣分析均示代謝性酸中毒。GnRH激發試驗：例3，FSH在0、30、60、90、120 min分別為0.51、2.89、3.43、4.16、4.18 IU·L-1，LH在0、30、60、90、120 min分別為<0.2、1.58、1.54、1.33、1.47 IU·L-1；例4，FSH 25.86 IU·L-1，LH 18.38 IU·L-1。例5、例6患者行精液分析提示無精癥。其他內分泌激素結果詳見表3。

表3 7例患者激素結果

2.3 影像學檢查除1例未查外，余6例腎上腺CT均示雙側腎上腺增粗(見圖1)。盆腔彩超示4例女性患者中僅1例未探及，余呈幼稚子宮；2例男性患者(例5、例6)均示雙側睪丸微石癥、精囊區囊腫，其中例5曾行“雙側精索靜脈高位結扎術+包皮環切術+雙側睪丸切開活檢術”，病理未見(院外)，例6行“睪丸占位切開取活檢術”，病理示“雙側睪丸間質細胞瘤樣增生”。已查的5例垂體磁共振成像示例5垂體后異常信號影(考慮Rathke裂隙)，余未見異常。3例行左手正位片示2例存在骨齡提前(見圖2)。

圖1 例6腹部CT(平掃+增強)示雙側腎上腺增生，左側腎上腺內側支血管平滑肌脂肪瘤

圖2 例3(6歲)左手正位片示骨齡提前(約13歲)

2.4 基因突變分析所有患者均檢測出CYP21A2基因變異(見圖3)，其中例1同時存在CYP21A2基因外顯子1～7雜合缺失。共檢出7種突變類型(見表4)，包括2種剪接突變(c.292+1G>A、c.293-13C/A>G)；2種錯義突變(c.518T>A、c.1069C>T)；2種缺失突變(c.740delA、外顯子1～7大片段缺失)；1種缺失插入突變(c.1451_1452delGGinsC)。4例行家系成員基因篩查，結果詳見表4。

表4 7例21-OHD患者CYP21A2基因的測序結果

A為例1攜帶c.740delA純合變異；B為例2攜帶c.292+1G>A雜合變異；C為例2攜帶c.293-13C/A>G雜合變異；D為例5攜帶c.293-13C>G純合變異；E為例3攜帶c.518T>A純合變異；F為例4攜帶c.518T>A雜合變異；G為例4攜帶c.1451_1452delGGinsC雜合變異；H為例6攜帶c.1069C>T純合變異。

3 討論

21-OHD是由編碼21-羥化酶的CYP21A2基因突變導致的一種常染色體隱性遺傳病，為CAH的最常見類型。該基因突變致酶活性喪失或降低，使通路中孕酮、17-羥孕酮不能正常轉化為11-脫氧皮質酮、11-脫氧皮質醇，致皮質醇、醛固酮合成減少，ACTH負反饋分泌增加，腎上腺皮質增生，同時造成上述前體物質大量堆積并向雄性激素轉化。CAH主要臨床特征為不同程度的腎上腺皮質功能減退、性分化與發育異常、伴或不伴體液平衡紊亂。根據國外流行病學研究顯示，典型21-OHD活產兒的發病率為0.07‰～0.1‰，非經典型性的發病率則更高[3-4]。

根據酶缺陷程度的不同，21-OHD可分為經典型和非經典型(nonclassical，NC)，前者又分為SW型和SV型[5-6]。SW型，多見于新生兒，常于出生后1～4周出現嘔吐、腹瀉、喂養困難、脫水、體質量不增、低血糖等非特異性癥狀就診，女嬰因外生殖器畸形易于早期識別，男嬰則不易識別，常因低鈉血癥、高鉀血癥、代謝性酸中毒、自發性低血壓、休克等腎上腺危象而危及生命。本研究中，例1(女嬰)生后即發現陰蒂肥大，無失鹽表現，例2(男嬰)存在喂養困難、脫水貌、重度營養不良、生長發育落后等失鹽表現，隨診中2例均存在高鉀、低鈉血癥，代謝性酸中毒，確診為SW型。SV型，除無失鹽表現、電解質紊亂外，余同失鹽型。本研究中，3例女性SV型患者中有2例出現性早熟(例3為外周性，例4為中樞性)，另1例女性患者(例7)，盡管20歲行外陰整形術，因未明確診斷，術后未能及時補充糖皮質激素，于40歲確診，至今未婚未育，伴有嚴重的心理障礙。2例男性SV型患者(例5、例6)，均因“婚后不育”就診，分別于32、33歲確診。非經典型，癥狀隱匿，女性多于男性，前者往往以多毛、痤瘡、脫發、月經異常、多囊卵巢、不孕癥等原因就診，后者可無癥狀或僅表現為不育。對于癥狀不典型的SV型或NC型患者，應盡早行基因檢測明確診斷。

CYP21A2基因位于6p21.3，由494個氨基酸組成，與無功能的假基因CYP21A1P高度同源(二者相距30 Kb)，與編碼補體的C4A及C4B基因相毗鄰[7-8]。真假基因間的重排是引起21-OHD致病突變的主要分子病理基礎[1,9]。迄今為止，已報道的CYP21A2基因突變類型將近300種[8,10]。眾多研究已證實，CYP21A2基因突變譜和熱點突變在不同群體之間存在種族差異[11-13]。在55例21-OHD的印度患者中，53例檢出雙等位基因突變(14例純合突變，39例復合雜合突變)，其中c.293-13C/A>G(20%)突變最為常見，其次為c.1069C>T(14.5%)、c.518T>A(12.7%)和8-bpdel(12.7%)[12]。Wang等[13]對230例中國21-OHD患者(142例SW型、60例SV型、28例待分型)進行CYP21A2基因變異分析，發現最常見的變異位點是c.293-13C/A>G(35%)，其次為c.518T>A(14.3%)、c.1069C>T(5.9%)，與本研究結果相符。值得一提的是，大片段的缺失/轉化被描述為一些地區國家檢測到的最常見突變。Chi等[11]對一項來自204個家庭的212名21-OHD越南患者的隊列研究顯示，缺失突變(占34.48%)為CYP21A2最常見的基因突變類型，其次是c.293-13C/A>G(28.57%)、c.1069C>T(15.51%)和c.518T>A(10.59%)。同樣，缺失突變在中國香港、伊拉克、伊朗、德國、奧地利等多個國家的研究中也最常見[14-16]。日本學者Koyama等[17]曾在1例SW型患者中發現c.740delA突變，并預測其會破壞正常閱讀框，致P450多肽血紅素結合區之前mRNA過早終止，最終導致酶活性完全喪失，本研究中也有此突變位點的報告(即例1的c.740delA純和突變、外顯子1～7雜合缺失)。因此，對于患兒基因突變陽性而父母陰性的病例，應需進一步行MLPA基因檢測，以明確有無大片段基因缺失的可能。此外，c.292+1G>A突變位于內含子2經典剪切位置區域，c.1451_1452delGGinsC位于10號外顯子，兩者均為罕見突變，最初分別被Lee等[18]和Wedell等[19]所報道，預測與SW型21-OHD有關。

21-OHD治療目標在于激素替代，抑制高雄激素血癥，即模擬最佳生長曲線，促進第二性征發育，維持正常生殖功能和預防代謝健康問題(如高血壓、糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常、心腦血管疾病等)。其治療方案的選擇有賴于疾病分型、年齡以及有無應激反應、合并癥、并發癥等。糖皮質激素是此病治療的關鍵，部分尚需聯合鹽皮質激素、性激素替代和促生長藥物等綜合支持治療。值得注意的是，對于骨骺尚未閉合的患兒，宜應用氫化可的松，不宜用強的松或地塞米松治療，以免促進骨骺閉合，影響最終身高。

總之，本研究對象臨床表型均符合21-OHD，均存在CYP21A2基因突變，且以純合突變或復合雜合突變為主，CYP21A2基因可能為21-OHD的致病基因。鑒于21-OHD臨床異質性較大，尤其對于非典型患者更容易漏診或延誤診治，聯合基因檢測至關重要，有助于該病的早期診治及改善預后。