豬細小病毒病滅活疫苗滅活工藝研究

陳丕坤，李 倩

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬細小病毒（PPV）主要引起母豬產畸形胎、死胎、木乃伊胎以及流產、不孕、不發情等繁殖障礙病[1]，大多是通過母豬與仔豬之間的胎盤垂直傳播，也經常由配種公豬通過其精液傳染給易感母豬。PPV感染普遍存在于世界各地的豬群中，發病沒有明顯的季節性，但由于豬群的交配和母豬的生產通常在春季和秋季進行，故春秋季節豬細小病毒病的發病率相對較高[2]。為了給豬細小病毒病的防控提供安全可靠的滅活疫苗，本試驗探討了滅活劑二乙烯亞胺（BEI）對豬細小病毒的滅活條件，從而為制備豬細小病毒滅活疫苗提供試驗參考。

1 材料

1.1 細胞

ST細胞工作細胞庫，由哈藥集團生物疫苗有限公司保存和提供。

1.2 病毒液

豬細小病毒L株病毒液，豚鼠紅細胞凝集價為1∶512，病毒含量為107.36TCID50·mL-1，由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、保存和提供。

1.3 主要試劑

2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）購自Sigma公司；DMEM培養基、新生牛血清、0.25%胰酶購自Gibco公司。

2 方法

2.1 BEA的環化

將BEA按2%的量加至0.2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中，置37℃水浴，每10～15 min振搖1次，作用1 h，即環化為二乙烯亞胺（BEI），無菌過濾。

2.2 豬細小病毒L株病毒液的滅活工藝研究

取豬細小病毒L株病毒液，分別按照975、990 mL·瓶-1和995 mL·瓶-13個規格定量分裝到5 L的三角瓶內，然后按分裝規格的不同將病毒液分成3組。加入2%的BEI溶液至1 000 mL，使第1組BEI的終濃度為0.05%，第2組BEI的終濃度為0.02%，第3組BEI的終濃度為0.01%，邊搖邊加，搖勻后倒瓶。將加入BEI后的病毒液置30℃下進行滅活。每隔4～6 h搖勻1次，待病毒液溫度達到規定的溫度時開始計時，分別于滅活后24、36、48、60、72、84 h用終濃度為2%的硫代硫酸鈉溶液終止滅活，并分別從每瓶中抽取5 mL進行滅活效果檢驗。

2.3 紅細胞凝集價測定

按現行《中國獸藥典》附錄進行測定。

2.4 滅活檢驗

取1 mL滅活的豬細小病毒L株病毒液，接種到新消化的ST細胞培養瓶中（75 cm2），置37℃下培養72 h，接種細胞盲傳2代，觀察細胞病變情況并對收獲的這三代細胞液進行紅細胞凝集價檢測。

2.5 滅活驗證

取豬細小病毒L株病毒液980 mL，按照在滅活工藝研究中確定的滅活參數進行3次滅活驗證。

3 結果與分析

3.1 豬細小病毒L株病毒液的滅活工藝研究結果

對豬細小病毒L株病毒液用不同終濃度的BEI溶液、不同滅活時間進行滅活參數確定。BEI溶液終濃度為0.01%時不同時間取樣接種細胞，均出現細胞圓縮、皺縮等不同程度的細胞病變，個別能檢測出血凝效價，結果詳見表1。

表1 不同終濃度BEI溶液對豬細小病毒L株病毒液的滅活效果

續表

BEI溶液終濃度分別為0.02%和0.05%，滅活60 h以上可以使病毒液滅活完全。為保證大規模生產中病毒的滅活效果和疫苗使用過程的安全性，確定使用終濃度為0.02%的BEI溶液、在30℃條件下滅活72 h作為豬細小病毒L株病毒液的滅活工藝。

3.2 滅活驗證結果

滅活驗證結果見表2。

表2 豬細小病毒L株病毒液滅活驗證結果

對豬細小病毒L株病毒液按照終濃度為0.02%的BEI溶液、在30℃條件下滅活后72 h，用終濃度為2%的硫代硫酸鈉溶液終止滅活，并進行3次滅活驗證，結果顯示所有組別均滅活徹底。

4 結論

通過對豬細小病毒L株病毒液滅活工藝中BEI的終濃度和滅活時間比較，以及根據所確定的滅活工藝對病毒液進行滅活驗證，確定用終濃度0.02%的BEI溶液，在30℃條件下滅活72 h，用終濃度為2%的硫代硫酸鈉溶液終止滅活，作為豬細小病毒病滅活疫苗的滅活工藝。