硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制作用

芶 琳，盧 航，王西瑤，劉曉倩

(1.四川農業大學生命科學與理學院，2.四川農業大學風景園林學院，3.四川農業大學農學院,四川 成都 611130)

酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一種含銅的金屬氧化酶，廣泛分布于生物體內，具有多重生物學功能，可催化L-酪氨酸(L-Try)羥化生成L-多巴(L-DOPA)，還可催化L-DOPA氧化生成多巴醌，兼有單酚酶和二酚酶的活性，多巴醌再進一步反應則可形成黑色素[1-2]．酪氨酸酶是生物體黑色素合成的關鍵酶，昆蟲抗紫外線、果蔬褐變以及人體色素沉著性疾病都與酪氨酸酶的表達和活性密切相關[3-6]．抑制酪氨酸酶的活性，有助于控制生物體黑色素的生成．因此，酪氨酸酶抑制劑的篩選受到了國內外學者的廣泛關注．酪氨酸酶抑制劑不僅能作為化妝品中的美白成分以及防止果蔬褐變等，還可用于人體色素沉著性疾病藥物的研發．關于酪氨酸酶抑制劑的研究已有較多的報道：杜志云等[7]報道了姜黃素類化合物及其衍生物作為酪氨酸酶抑制劑；陸珊等[8]研究了曲酸對酪氨酸酶的抑制；陳清西等[9-12]測定了3,5-二羥基二苯乙烯、甘醇酸、苯甲酸和VB1等對酪氨酸酶的抑制作用；汲逢源等[13]的研究表明，培養基中加入硫代硫酸鈉等抗氧化劑能有效地抑制大豆下胚軸在組培過程中褐化發生．我們以酪氨酸酶為靶酶篩選該酶的抑制劑時，則發現硫代硫酸鈉對酪氨酸酶有抑制作用，且未見相關報道．本文以硫代硫酸鈉作為效應物,研究其對酪氨酸酶的抑制作用，分析其量效關系，并結合酶動力學方法研究硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制機理，以期為酪氨酸酶抑制劑分子設計和實際應用提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材 料

蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase,比活力 1 000 U/mg)、L-DOPA購自Sigma公司；L-Tyr購自Aldrich化學公司；硫代硫酸鈉、磷酸鹽等試劑均為國產分析純．UV-1240 型紫外可見分光光度計購自SHIMADZU公司．

1.2 方 法

1.2.1 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶活力的影響

單酚酶活力測定[14]，以L-Tyr為底物，在含有不同濃度的硫代硫酸鈉溶液中，加入酪氨酸酶(終質量濃度為32 μg/mL)，30 ℃下，測定波長為475 nm的吸光值隨時間的增長曲線．曲線呈直線關系后即達到酶促反應的穩定態，此時直線的斜率即為酪氨酸酶單酚酶穩定態活力，而直線與橫軸的交點則為酶促反應的遲滯時間．

1.2.2 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶活力的影響

酪氨酸酶二酚酶活力測定參考文獻[15]．酶活力測定體系為1 mL,在50 mmol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，以2 mmol/LL-DOPA為底物，加入10 μL 0.4 mg/mL酪氨酸酶溶液，立即混勻，30 ℃恒溫條件下，測定492 nm波長的吸光值，以每分鐘吸光值的變化表示其酶活力．

硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶活力的影響：以L-DOPA為底物，加入不同濃度硫代硫酸鈉溶液(由50 mmol/L，pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制的硫代硫酸鈉溶液)，其他條件同上，L-DOPA終濃度為2 mmol/L，磷酸鹽緩沖液終濃度為50 mmol/L，pH 6.8，最后加入10 μL 0.4 mg/mL酪氨酸酶溶液，492 nm波長下測定酶的活力．

1.2.3 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶的抑制動力學測定

在上述酶測活體系中，L-DOPA濃度不變，改變酶濃度，測定不同濃度的硫代硫酸鈉對酪氨酸酶活力的影響．測定酶促反應速度與酶濃度的關系，根據其相關性來判斷硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制是否可逆．

硫代硫酸鈉與酪氨酸酶抑制類型測定，則在含有不同濃度硫代硫酸鈉的測活體系中，固定酪氨酸酶的濃度，改變底物L-DOPA的濃度，測定不同濃度硫代硫酸鈉對酶活力的影響．經Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，確定抑制類型．并以截距對效應物濃度再二次作圖，求抑制常數．

2 實驗結果

2.1 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶活力的影響

以L-Tyr為底物,測定不同濃度硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶活力的影響．結果顯示(圖1)隨著硫代硫酸鈉濃度的增大，酪氨酸酶單酚酶穩態的速率下降，且遲滯時間延長．遲滯時間和穩態酶活力分別對硫代硫酸鈉濃度作圖(圖2,3)．25 mmol/L 硫代硫酸鈉可使單酚酶的遲滯時間從19.3 s 延長到52.6 s．穩態酶活力隨著硫代硫酸鈉濃度的升高而有所下降．實驗結果表明硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶具有一定的抑制作用．

圖1 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶活力的影響Fig.1 Effects of sodium thiosulfate on the monphenolase activity of tyrosinase

圖2 硫代硫酸鈉對遲滯時間的影響Fig.2 Effect of sodium thiosulfate on the lag time

圖3 硫代硫酸鈉對穩定態速率的影響Fig.3 Effect of sodium thiosulfate on the steady state rate

2.2 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶活力的影響

以L-DOPA為底物,在含有不同濃度的硫代硫酸鈉的測活體系中檢測酶活力，以不加硫代硫酸鈉為對照，獲得酶的相對剩余活力．結果顯示(圖4)，硫代硫酸鈉對酪氨酸酶有顯著的抑制作用，隨著硫代硫酸鈉濃度的增大,酶活力逐漸下降，硫代硫酸鈉濃度在2.5～15 mmol/L之間，酶活力下降較為明顯，酶活力降至50%時的抑制劑濃度IC50為8.80 mmol/L．

圖4 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶二酚酶活力的影響Fig.4 Effects of sodium thiosulfate on the diphenolase activity of tyrosinase

2.3 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制動力學

在測活體系中，固定底物L-DOPA的濃度，改變酪氨酸酶的濃度，測定不同硫代硫酸鈉濃度下酪氨酸酶的活力．結果如圖5，酶活力對酶量作圖為一組經過原點的直線，隨著硫代硫酸鈉濃度的增大，直線斜率降低．表明硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆性抑制，即酶活力的下降不是通過酶量的減少所致，而是硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制作用的結果．

圖5 不同硫代硫酸鈉濃度下酪氨酸酶活力和酶量的關系Fig.5 Effects of concentrations of sodium thiosulfate on the activity of tyrosinase

在含不同濃度硫代硫酸鈉的測活體系中，測定酶催化不同濃度的L-DOPA反應的速率，經Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，得到一組橫軸截距不變的直線(見圖6)．由圖可見，硫代硫酸鈉作為酪氨酸酶的抑制劑，最大反應速度(Vm)隨著抑制劑濃度的增大而減小，米氏常數(Km)值則保持不變，增加底物濃度并不能排除抑制劑對酶的抑制效應，其抑制類型為非競爭性．以不同濃度硫代硫酸鈉的1/Vm(intercept)對抑制劑濃度作圖(圖7)為一條直線,從直線的斜率求得抑制常數KI，即KI=5.674 mmol/L．

圖6 硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制類型Fig.6 Inhibition type of sodium thiosulfate on tyrosinase

圖7 抑制常數的測定Fig.7 Determination of inhibition constant

3 討 論

酪氨酸酶作為生物黑色素形成過程中的關鍵酶，對生物黑色素的生成起到了重要的調控作用．由于果蔬的褐化、昆蟲抗紫外線和皮膚沉著性疾病等都與酪氨酸酶的表達以及活性相關．在農業上抑制酪氨酸酶有助于保持果蔬的營養品質和提高感官品質，還可通過酪氨酸酶抑制效應物研制抗蟲殺蟲藥物．而在醫藥上酪氨酸酶抑制劑則可用于預防和治療皮膚沉著性疾病．除此之外，酪氨酸酶抑制劑還可作為皮膚美白成分添加到化妝品中．因此篩選和研制有效的酪氨酸酶抑制劑廣受國內外學者的關注．關于小分子化合物作為酪氨酸酶抑制劑也已有報道[16]，但硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制作用還未見報道.本文以硫代硫酸鈉作為效應物，探討硫代硫酸鈉對酪氨酸酶的抑制機理，經酶的抑制動力學研究表明，硫代硫酸鈉對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均有抑制作用，單酚酶表現為遲滯時間延長，與大多數抑制劑對酪氨酸酶單酚酶的作用特征相同[17]．對二酚酶則表現出明顯的效應物濃度依賴關系，抑制作用為可逆非競爭性抑制，其特征是Km值不變，Vm陏抑制劑濃度增加而減小．抑制劑既能與游離的酶分子結合，還可以和底物-酶復合物結合，抑制劑與酶分子應是在酶活性中心以外的區域結合，最終由于形成底物-酶-抑制劑三元復合物而無法分解為產物，從而抑制了酪氨酸酶的催化活性．由此推測，硫代硫酸鈉與酶分子結合后，可能誘導酶分子構象改變，引起酶活性下降．確切的證據有待于進一步研究．此項研究擴充了硫代硫酸鈉的應用范圍．作為酪氨酸酶抑制劑，本研究可為研發新型的酪氨酸酶抑制劑提供依據．

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