雙環醇、聯苯雙酯、五味子丙素的UHPLC-ESI-Q-TOF-MS分析及其應用

段華健 武正華 余史丹 汪碩聞 陳明 范國榮

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1692-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.05

摘 要 目的：分析雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素的質譜裂解規律，鑒定雙環醇原料藥中的雜質。方法：采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間質譜法，以電噴霧電離源為離子源，在正離子模式下，利用飛行時間質譜對雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素的準分子離子及其特征碎片離子信息進行分析，根據碎片質量變化推測可能的裂解途徑，分析總結其質譜裂解規律;雙環醇原料藥樣品首先通過液相色譜分離，尋找其中的雜質峰，然后利用質譜對雜質峰進行分析，結合裂解規律輔助鑒定雜質的結構。結果：3種化合物在正離子模式下均產生[M+H]+的準分子離子，經碰撞誘導解離后發生C—O鍵、C—C鍵的簡單斷裂以及氧環的開環斷裂，并伴隨以CH2O為主，CO2、CO、CHO為輔的中性碎片丟失，解離均集中在中高質量區。3種化合物只有支鏈結構和/或氧環結構發生C—C、C—O鍵的簡單斷裂，而聯苯母核結構未曾改變。其中，雙環醇由于含有芐位羥基結構，故在酸性流動相條件下，會以[M+H-H2O]+的形式穩定存在;五味子丙素因其含有八元環結構，故碰撞電壓下率先出現開環，繼而再出現中性碎片丟失。雙環醇原料藥中雜質的二級質譜與聯苯雙酯的二級碎片表現出的質譜裂解行為基本一致。結論：本研究歸納了3種五味子衍生物的質譜裂解規律。雙環醇原料藥中出現的雜質可能為聯苯雙酯。

關鍵詞 雙環醇;聯苯雙酯;五味子丙素;超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間質譜;質譜裂解規律;雜質鑒定

UHPLC-ESI-Q-TOF-MS Analysis of Bicyclol， Bifendate and Schisandrin C and Application

DUAN Huajian1，2，WU Zhenghua2，YU Shidan3，WANG Shuowen2，CHEN Ming2，FAN Guorong1，2（1. School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201100， China; 2. Dept. of Clinical Pharmacy， the First Affiliated Peoples Hospital of Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200080， China; 3. Dept. of Pharmacy， No. 906 Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA， Zhejiang Ningbo 315040， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To analyze the mass spectrometry fragmentation regularity of bicyclol， bifendate and schisandrin C， and to identify the impurities of bicyclol raw material. METHODS： UHPLC-ESI-Q-TOF-MS method was adopted. Using electrospray ionization source， in positive ion mode， the excimer ion and characteristic fragments of bicyclol， bifendate and schisandrin C were analyzed by means of TOF-MS. According to the mass change of fragments， the possible fragmentation pathways were speculated， and the fragmentation regularity were analyzed and summarized. Bicyclol raw material sample was first separated by liquid chromatography to find the impurity peaks in it， and then the impurity peaks were analyzed by mass spectrometer; the impurity identification was conducted by combining with the fragmentation regularity. RESULTS： The 3 compounds all produced [M+H]+ excimer ion in the positive ion mode. After collision-induced dissociation， the C-O bond， the simple rupture of the C-C bond and the ring-opening cleavage of the oxygen ring occurred; with the loss of neutral fragments， mainly CH2O， supplemented by CO2， CO and CHO， the dissociation was concentrated in the middle and high quality regions. C-C and C-O bonds of 3 compounds were simply broken only in the branched chain structure and/or oxygen ring structure， but the structure of the biphenyl parent nucleus remained unchanged. Among them， the bicyclol contained a benzyl alcohol structure， so under acidic mobile phase conditions， it would exist stably in the form of [M+H-H2O]+. Because schisandrin C contained 8-membered ring structure， ring opening first occurred under collision voltage， and then neutral fragment loss occurred. The secondary mass spectra of impurity in bicyclol raw material were consistent with the mass spectra fragmentation of secondary fragments of bifendate. CONCLUSIONS： The study summarized mass spectrometry fragmentation regularity of 3 schisandrin derivatives. The impurity in bicyclol raw material may be bifendate.

KEYWORDS? ?Bicyclol; Bifendate; Schisandrin C; UHPLC- ESI-Q-TOF-MS; Mass spectrum fragmentation regularity; Impurity identification

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.或華中五味子S. Sphenanthera Rehd. et Wils的干燥成熟果實。因其辛、甘、苦、澀、咸共生五味，故被稱為五味子[1]。五味子的果實、種子含豐富的木脂素類化合物，如五味子醇，五味子甲素、乙素、丙素以及五味子酚等[2]。經研究發現，所有活性成分中五味子丙素（結構式見圖1A）的保肝作用最強，但含量較低[3]。為此，研究者合成了五味子丙素及其衍生物，經篩選后，得到了易于合成且能夠大規模生產的聯苯雙酯（結構式見圖1B），該衍生物可顯著下調乙肝患者的轉氨酶水平，但具有停藥反跳現象[4]。隨后，經過結構優化，研究者合成了新的衍生物雙環醇（結構式見圖1C），該衍生物在延續聯苯雙酯保肝作用的同時，其停藥反跳現象的發生率遠低于聯苯雙酯，故在臨床上得到了廣泛應用[5-6]。

鑒于雙環醇具有良好的保肝降酶作用，并且臨床上應用廣泛，因此研究其有關物質具有重要意義。雙環醇有關物質的深入研究需通過高分辨質譜分析提供基礎信息支撐。電噴霧-四極桿-飛行時間質譜（ESI-Q-TOF- MS）作為高分辨質譜，是通過軟電離技術，在測定化合物精確分子量的同時，提供準確且豐富的碎片信息，尤其適用于未知化合物的結構鑒定[7]。該技術現已被廣泛應用于中藥、化學藥和生物大分子等研究領域[8-10]。關于五味子類衍生物的結構鑒定，目前有賀銳銳等[11]采用Discovery Studio軟件探究了五味子乙素質譜裂解途徑，靳茂禮等[12]對五味子酯甲的代謝產物進行了鑒定，但現有研究并不全面。基于此，本研究采用超高效液相色譜（UHPLC）-ESI-Q-TOF-MS法，在正離子模式（ESI+）下，經碰撞誘導解離（CID）獲取碎片的二級質譜信息，并以此初步推測五味子丙素、聯苯雙酯、雙環醇的裂解途徑，從而總結得到這3種化合物的裂解規律，再根據此初步鑒定雙環醇雜質的結構，旨在為雙環醇質量控制提供參考，也為其他五味子衍生物的結構分析奠定理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究主要儀器包括Agilent 1290型UHPLC儀（配有G7120A型二元泵及內置脫氣機、G7159B型自動進樣器、G7116B型柱溫箱、Mass Hunter 10.0在線分析軟件）和G6545型Q-TOF型質譜儀（美國Agilent公司）、CPA-225D型電子天平（德國Satorius公司）、Centrifuge 5804R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）、SK5200H型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）、Research UV型超純水機（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

雙環醇原料藥（批號170657，純度98.0%）購自北京協和藥廠;聯苯雙酯對照品（批號100192-201504，純度98.0%）購自中國食品藥品檢定研究院;五味子丙素對照品（批號MB6954，純度98.0%）購自大連美侖生物技術有限公司;甲醇和乙腈均購自德國Merck公司，均為色譜純;甲酸和乙酸銨均購自上海安譜實驗科技有限公司，均為分析純;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

精密稱定雙環醇原料藥、聯苯雙酯對照品、五味子丙素對照品各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，超聲（功率200 W，頻率53 kHz，下同）10 min使完全溶解，得上述成分質量濃度均為1 mg/mL的貯備液，于4 ℃下儲存。取上述貯備液適量，用80%甲醇梯度稀釋制成質量濃度為1 μg/mL的標準溶液，臨用現配。取上述3種樣品的標準溶液各100 μL，置于同一EP管中，超聲5 min使充分混勻，得到質量濃度均為0.33 mg/mL的混合標準溶液，備用。

2.2 UHPLC條件

以Dikma Diamonds C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱;以2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸溶液為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫（0～1 min，40%B→70%B;1～4 min，70%B;4～4.5 min，70%B→95%B;4.5～8 min，95%B）;流速為1 mL/min;柱溫為25 ℃;檢測波長為276 nm;進樣量為15 μL;分流比為3 ∶ 7。

2.3 質譜條件

離子源為ESI，掃描模式為ESI+;鞘氣溫度為350 ℃，流速為11 L/min;霧化溫度為320 ℃，霧化氣電壓為35 psi;干燥氣流速為8 L/min;錐孔電壓為65 V;毛細管電壓為175 V;碰撞電壓為10～30 V;掃描范圍為m/z 100～1 700。

2.4 色譜和質譜分析

吸取混合標準溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”項下條件進樣，先經UHPLC分離后再進入質譜分析。首先，由一級質譜提取離子流（EIC）圖得到每個化合物的保留時間（RT）和準分子離子的精確m/z值;然后以準分子離子的m/z值作為靶m/z值，以RT前后0.5 min作為掃描時間范圍，并在適宜碰撞電壓下進行Target MS/MS掃描。經CID得到化合物的二級碎片，記錄特征碎片離子信息，并根據碎片離子m/z值的變化情況，推測其可能的結構。

2.5 雜質鑒定

吸取雙環醇標準溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”項下條件進樣分析，并以80%甲醇作為空白對照。首先經UHPLC的紫外（UV）檢測，尋找除雙環醇色譜峰以外的其他特征色譜峰，然后在一級質譜圖中查找該色譜峰對應化合物的RT和m/z值。二級碎片采集操作同“2.4”項，根據得到的碎片信息結合質譜裂解規律進行雜質的初步鑒定。

2.6 軟件輔助分析

采用Mass Hunter Qualitative Analysis 10.0軟件對所有化合物的質譜數據進行采集和定性分析。首先，采用軟件中的“generate formula”功能，通過限制C、H、O以及不飽和鍵的數量來確定特征峰對應化合物的分子式;然后，使用Molecular Structure Correclator 8.1軟件，根據二級碎片離子信息并結合原型藥的分子結構，對碎片離子的結構進行推測，以輔助裂解過程的推斷（上述軟件均來源于美國Agilent公司）。

3 結果與分析

3.1 3種化合物的色譜和質譜信息

色譜結果顯示，雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素的RT依次約為3.0、3.9、7.2 min，詳見圖2。

質譜結果顯示，隨著碰撞電壓的增加，雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素二級碎片數量也隨之增加。在動態變化過程中，通過斷裂時的電壓推斷支鏈結構的穩定性，對于分析支鏈斷裂順序具有重要的指導意義。分析二級質譜信息，以質量偏差（ppm）小于2×10-6、碎片響應值大于1×103為標準，歸納雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素的主要特征碎片離子信息，詳見表1～表3。

3.2 雙環醇的質譜裂解途徑

雙環醇在ESI+下產生質子化離子m/z 391.034 1[M+H]+為其準分子離子峰。該成分C2位含芐位羥基，會脫去1分子H2O產生m/z 373.091 9的碎片離子，得到其二級質譜擬合圖見圖3。

雙環醇的碎裂反應主要由CID引發[13]，由圖3可知，裂解行為主要集中在中高質量區，在脫水得到的m/z 373.091 9的母離子基礎上，首先C2′位酯鍵斷裂丟失1分子CH2O，得到m/z 343.081 1的碎片離子。該碎片可繼續于C2′、C4′位發生簡單斷裂丟失1分子CHO和1分子CH2O，得到m/z 314.078 4、284.067 4的碎片離子;也可于C5、C6位發生兩個C—O鍵斷裂，氧環開環后失去1分子CO2，得到m/z 299.091 4的碎片離子。該碎片有兩種裂解方式，一種先開環后支鏈發生簡單斷裂，于C5、C6位開環斷裂失去1分子CO，得到m/z 271.096 1的碎片離子，繼而于C4′、C2′位發生兩次簡單斷裂，先后得到m/z 241.049 1和m/z 213.090 9的碎片離子;另一種為C4′支鏈結構先發生簡單斷裂得到m/z 269.080 6的碎片離子，然后氧環開裂，最終也得到m/z 213.090 9的碎片離子。推測雙環醇可能的裂解途徑如圖4所示。

3.3 聯苯雙酯的質譜裂解途徑

聯苯雙酯在ESI+下產生質子化離子m/z 419.239 9

[M+H]+為其準分子離子峰，又經CID，得到其二級質譜擬合圖見圖5。

在ESI+下，聯苯雙酯得準分子離子峰[M+H]+，經CID共產生6個特征碎片，其裂解方式與雙環醇相似，但過程更為簡單。由圖5可知，裂解行為主要集中在中高質量區，首先C2′位酯鍵斷丟失1分子CH4O，得到m/z 387.070 6的碎片。該碎片有兩種裂解方式，一種于C2、C4、C4′位發生連續C—O鍵的簡單斷裂，相繼丟失1分子CH2O和1分子CHO，得到m/z 357.060 2和328.057 8的碎片離子;另一種是位于C5、C6位的氧環先開裂，丟失1分子CO2，得到m/z 343.081 3的碎片，隨后C2、C4、C4′位發生簡單斷裂，形成m/z 313.034 3、285.075 7的碎片離子。推測聯苯雙酯可能的裂解途徑如圖6所示。

3.4 五味子丙素的質譜裂解途徑

五味子丙素在ESI+下產生質子化離子m/z 385.164 6

[M+H]+為其準分子離子峰，又經CID，得到其二級質譜擬合圖見圖7。

由圖5可知，五味子丙素經CID產生5個主要碎片離子峰。裂解過程與前人研究得到五味子乙素裂解的碎片情況基本相似[11]，亦與上述雙環醇、聯苯雙酯的裂解行為類似。特殊之處在于五味子丙素含八元環結構，會發生2個C—C鍵的均裂脫，失去1分子C5H10使體系趨于穩定，得到m/z 315.089 3的碎片離子。從分子式水平分析，上述碎片離子的O原子數與母離子相同，而另一m/z 355.153 7的碎片離子的O原子數較母離子減少1，故通過O原子的變化情況可以推斷出前一碎片離子由母離子直接得到。推測五味子丙素可能的裂解途徑如圖8所示。

3.5 雜質的鑒定結果

在對雙環醇原料藥進行色譜和質譜分析時，檢測到1個雜質（圖9），RT為3.846 min，該保留時間與聯苯雙酯的保留時間基本一致，為確定雜質成分，采用ESI-Q-TOF-MS做進一步的檢測。

該雜質在ESI+下也產生m/z 419.240 5[M+H]+的準分子離子峰，經CID得到的二級質譜檢測結果顯示，該雜質共產生6個主要特征碎片離子，且碎裂集中在高質量區，擬合圖見圖10。其中，該雜質產生m/z 387.071 1、357.060 5的碎片離子，與準分子離子差30和60，即連續丟失1分子或2分子CH2O，說明雜質中含有多個—OCH3結構;除此之外，還有m/z343.081 2、328.057 8、313.064 3、285.075 7的特征碎片離子，推測為上述2個碎片離子丟失CO2、CH2O、CHO、CO丟失所致。對比主要特征碎片，結合質量數推測中性碎片丟失情況，該雜質的二級質譜與聯苯雙酯的二級質譜碎片表現出的裂解行為完全一致。查閱相關文獻證實，雙環醇的合成工藝中采用聯苯雙酯作為起始原料[14-15]，因此極有可能在生產過程中引入聯苯雙酯，故可判斷雙環醇中出現的雜質可能為聯苯雙酯。

4 討論

本實驗前期分別在ESI+、負離子模式（ESI-）下，利用高分辨質譜探究了雙環醇、聯苯雙酯、五味子丙素等3種化合物的質譜特征，并比較了其在不同碰撞電壓（10、20、30、40 V）下的碎片丟失情況。結果顯示，ESI-下的分子離子峰響應較ESI+低2個數量級，且離子豐度較低，故選用ESI+進行分析。由于40 V電壓強度過高，在該條件下化合物被打碎且無特征碎片離子形成，因此選擇在10～30 V的碰撞電壓下采集二級碎片信息。

雙環醇、聯苯雙酯、五味子丙素等3種化合物來源于中藥五味子，具有相似的聯苯結構，經CID可產生豐富的碎片信息，可初步鑒定其裂解途徑，并為其他五味子衍生物的結構鑒定提供參考。3種化合物裂解過程有相同點和不同處，可相互補充。在ESI+模式下，3種化合物均產生了[M+H]+的準分子離子，其中雙環醇因含有芐位羥基，容易脫水，故其準分子離子以[M+H-H2O]+的形式穩定存在。3種化合物的解離均集中在中高質量區。C2′位酯基易發生C—O鍵的均裂，由于化合物結構中含有多個—OCH3支鏈，因此會發生C—O鍵的簡單斷裂，從而導致多分子CH2O的丟失，基于化合物結構的特征性微小差異，裂解過程中還伴隨CO2、CO、CHO等中性碎片的丟失。3種化合物中雙鍵結構的β位均不含H，因此無法發生麥氏重排等復雜斷裂。此外，聯苯結構中兩個苯環以單鍵直接相連的形式，會形成一個巨大的共軛體系，有利于降低分子勢能而維持其穩定性[16]。因此在裂解過程中，3種化合物只有支鏈結構和/或氧環結構發生C—C、C—O鍵的簡單斷裂，而聯苯母核結構均未改變。上述規律在3種化合物的質譜裂解過程中均存在，具有共性，即可歸納為3種五味子衍生物的質譜裂解規律。

對于雙環醇原料藥UHPLC-UV圖譜中發現的雜質，通過色譜實現分離，再通過高分辨質譜對其二級碎片信息進行采集，經過對碎片的分析，發現其中性分子的丟失情況和質譜裂解行為與聯苯雙酯基本一致，符合上述工作中總結出的質譜裂解規律，得到的規律可以作為該種化合物雜質鑒定的輔助依據。

本實驗采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS法，通過對雙環醇、聯苯雙酯和五味子丙素等3種五味子衍生物的質譜裂解途徑進行研究，總結其質譜裂解規律，并將其用于輔助鑒定雙環醇雜質的結構，這不僅對五味子衍生物有關物質的快速鑒定具有重要意義，也為后續藥物代謝產物的分析鑒定提供了重要的理論支持。

參考文獻

[ 1 ] 郭冷秋，張鵬，黃莉莉，等.五味子藥理作用研究進展[J].中醫藥學報，2006，34（4）：51-53.

[ 2 ] 余凌虹，劉耕陶.五味子聯苯環辛烯類木脂素成分的結構與藥理活性關系和藥物創新[J].化學進展，2009，29（1）：66-76.

[ 3 ] CHEN N，KO M. Schisandrin B-induced glutathione antioxidant response and cardioprotection are mediated by reactive oxidant species production in rat hearts[J]. Biol Pharm Bull，2010，33（5）：825-829.

[ 4 ] CHEN H Y，HSIEH M T，WU C R，et al. Schizandrin protects primary cultures of rat cortical cells from glutamate-induced excitoxicity[J]. J Pharmacol Sci，2008，107（1）：21-31.

[ 5 ] HAN Y，SHI J P，MA A L，et al. Randomized，vitamin E-controlled trial of bicyclol plus metformin in non-alcoholic fatty liver disease patients with inpaired fasting glucose[J]. Clin Drug Investig，2014，34（1）：1-7.

[ 6 ] 李燕.雙環醇片的藥理研究和臨床應用[J].傳染病信息，2002，15（2）：60-61.

[ 7 ] 彭耀文，申蘭慧，王麗，等.液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術在藥物分析中的應用[J].中南藥學，2015，9（13）：962-965.

[ 8 ] GU X，CHEN Y，LOU Y J，et al. Separation and characte- rization of forced degradation products in homoharringtonine injection by UHPLC-Q-TOF-MS[J]. J Pharm Biomed Anal，2019，176：112801.

[ 9 ] 崔園園，周永峰，馬艷芹，等.基于UPLC-Q-TOF-MS法分析生、炙甘草中化學成分的差異性[J].中國藥房，2020，31（9）：1049-1053.

[10] CHEN K Y，LIU X G，WU X H，et al. The degradation dynamics and rapid detection of thiacloprid and its degradation products in water and soil by UHPLC-QTOF-MS[J].Chemosphere，2021，263：127960.

[11] 賀銳銳，譚鵬，韓靜，等.基于Discovery Studio軟件解析五味子乙素的電噴霧/質譜裂解途徑[J].世界科學技術（中醫藥現代化），2013，15（3）：527-530.

[12] 靳茂禮，李淳瑞，王玉峰，等.五味子酯甲在大鼠體內代謝產物的鑒定[J].中國現代應用藥學，2015，32（6）：695- 700.

[13] 尤珠雙.氮雜環類化合物在電噴霧質譜中的裂解機理研究[D].杭州：浙江大學，2012.

[14] 張純貞，胡偉，李燕.光活雙環醇及其制備方法和其藥物組合物的與用途，中國：CN02156723.9[P]. 2004-06-23.

[15] 洪果.抗肝炎藥雙環醇的合成新工藝研究[D].杭州：浙江工業大學，2015.

[16] 李艷梅.有機化學[M].北京：科學出版社，2015：77-79.

（收稿日期：2021-04-18 修回日期：2021-06-09）

（編輯：鄒麗娟）