DPP-4抑制劑LGT-6在不同種屬血漿中蛋白結合率的比較

廖偉科 楊華麗 王忠元 陳瑞 湯磊 崔杏 朱高峰

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1728-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.11

摘 要 目的：建立二肽基肽酶4抑制劑LGT-6在不同種屬血漿中蛋白結合率的測定方法并比較差異。方法：采用平衡透析法，以磷酸鹽緩沖液為透析外液，將3、30、300、3 000 nmol/L的LGT-6分別在大鼠、猴、人血漿（即透析內液）中平衡48 h。以甲苯磺丁脲為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定透析內、外液中LGT-6的濃度，計算血漿蛋白結合率。以ACQUITY UPLC HSS T3為色譜柱，以水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL;離子源為電噴霧離子源，監測模式為多反應監測模式，采集模式為正離子模式，定量分析用離子對分別為m/z 487.0→434.3（LGT-6）、m/z 271.1→172.0（內標）。結果：在3、30、300、3 000 nmol/L濃度下，LGT-6在大鼠血漿中的蛋白結合率分別為（96.25±0.97）%、（84.16±1.24）%、（78.25±0.61）%、（66.63±0.95）%，在猴血漿中的蛋白結合率分別為（98.54±0.58）%、（87.27±1.01）%、（79.35±0.86）%、（66.69±0.54）%，在人血漿中的蛋白結合率分別為（99.40±1.03）%、（84.48±1.15）%、（77.62±0.77）%、（66.93±0.48）%。在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結合率沒有明顯差異（P>0.05）;在相同種屬血漿中，不同濃度LGT-6的血漿蛋白結合率組間比較差異有統計學意義（P<0.05），且有隨藥物濃度的升高而降低的趨勢。結論：成功建立了測定LGT-6血漿蛋白結合率的方法。在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結合率沒有明顯的種屬差異，但有明顯的濃度依賴趨勢。

關鍵詞 二肽基肽酶4抑制劑;LGT-6;平衡透析法;超高效液相色譜-串聯質譜法;血漿蛋白結合率;不同種屬血漿

Comparison of Protein Binding Rate of DPP-4 Inhibitor LGT-6 in Different Species of Plasma

LIAO Weike1，2，YANG Huali3，WANG Zhongyuan3，CHEN Rui1，2，TANG Lei1，2，CUI Xing1，2，ZHU Gaofeng1，2? ? ? ? （1. Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D， Guiyang 550004， China; 2. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3. Dept. of Pharmacy， Guizhou Provincial Peoples Hospital， Guiyang 550002， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for determining protein binding rate of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor LGT-6 in different species of plasma， and to compare their difference. METHODS： By equilibrium dialysis， LGT-6 （3， 30， 300， 3 000 nmol/L） was equilibrated in rat， monkey and human plasma （i. e. internal dialysis solution） for 48 h， using phosphate buffer as the external dialysis solution. The concentration of LGT-6 in internal and external dialysis solution was determined by UPLC-MS/MS using tolbutamide as internal standard， and the plasma protein binding rate was calculated. The determination was performed on ACQUITY UPLC HSS T3 column with water （containing 0.01% formic acid）-acetonitrile （containing 0.01% formic acid） as mobile phase at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and the sample size was 2 μL. The ion source was electrospray ion source， and the multiple ion monitoring mode was used to carry out positive ionization scanning. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 487.0→434.3 （LGT-6）， m/z 271.1→172.0 （internal standard）， respectively. RESULTS： At the concentrations of 3， 30， 300， and 3 000 nmol/L， the protein binding rates of LGT-6 in rat plasma were （96.25±0.97）%， （84.16±1.24）%， （78.25±0.61）%， （66.63±0.95）%; the protein protein binding rates in monkey plasma were （98.54±0.58）%， （87.27±1.01）%， （79.35±0.86）%， （66.69±0.54）%; the protein binding rates in human plasma were （99.40±1.03）%， （84.48±1.15）%， （77.62±0.77）%， （66.93±0.48）%. At the same concentration， the protein binding rates of LGT-6 in rat， monkey and human plasma had no significant difference （P>0.05）. In the same species of plasma， there were significant differences in the plasma protein binding rates of different concentration of LGT-6 among those groups （P<0.05）， and it decreased with the increase of drug concentration. CONCLUSIONS： The method for the determination of plasma protein binding rate of LGT-6 is successfully established. The data revealed that the protein binding rate of LGT-6 is concentration-dependent， there was no obvious species difference on protein binding rates of LGT-6 in rat， monkey and human plasma under the same concentration.

KEYWORDS? ?Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor; LGT-6; Balanced dialysis; UPLC-MS/MS; Plasma protein binding rate; Different species of plasma

隨著發病率和致死率的逐年上升，糖尿病已成為全球最大的公共衛生事件之一[1]。相比于傳統的雙胍類、磺酰脲類、噻唑烷酮類、美脲類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素（易引起體質量增加、胃腸道不適、低血糖風險升高等）和新型治療藥物胰高血糖素樣肽1受體激動劑（需皮下注射給藥）、鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑（存在潛在的降低血壓及引起生殖感染的風險）等，二肽基肽酶4（DPP-4）抑制劑以其獨特的降糖機制以及較高的安全性引起了人們越來越多的關注[2-8]。經典的DPP-4抑制劑如沙格列汀、阿格列汀等均為每天給藥1次。然而，2型糖尿病是需要終身服藥的慢性代謝性疾病，患者對該病的治療需求已經逐漸從每天給藥1次向每周給藥1次轉變[9-10]。盡管長效抑制劑曲格列汀和奧格列汀已于2015年在日本獲批上市[1-2]，然而其原研企業均表示不會再尋求每周給藥1次的糖尿病藥物在除日本以外的國家上市[11-12]。因此，研發出具有自主知識產權的長效DPP-4抑制劑對于提高患者用藥依從性、降低長期給藥可能帶來的嚴重副反應等具有重要研究意義。

LGT-6的化學名為8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-7-（2-丁炔-1-基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[1-（4-甲基喹唑啉-2-基）乙基]-1H-嘌呤-2，6-酮（結構式見圖1），是本課題組前期以利格列汀為先導化合物，經過化學結構修飾而獲得的DPP-4抑制劑，其降糖活性、藥動學性質均優于利格列汀[13]。藥物的血漿蛋白結合率是指藥物入血后與血漿中所有蛋白結合的量占藥物總量的百分比，是反映藥物在體內吸收、分布、代謝、排泄過程的重要藥動學參數之一。藥物被吸收后，只有沒有與血漿蛋白結合的游離藥物才能通過生物膜并作用于靶器官而發揮藥理作用，故測定藥物與血漿蛋白的結合率在新藥研發及臨床研究中非常重要[14-15]。血漿蛋白結合會影響藥物在組織和血液中的藥動學特征以及后期相關制劑的給藥方案;此外，血漿蛋白結合率也是設置人體暴露安全范圍和臨床試驗劑量的重要依據。為此，本研究采用平衡透析法結合超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS法）測定LGT-6在不同種屬血漿中的蛋白結合率，為該化合物后期的藥效學、藥理學和臨床研究提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30AD型UPLC儀（日本Shimadzu公司）、TQ-6500+型質譜檢測儀（美國AB Sciex公司）、Thermo型恒溫培養箱（上海一恒儀器有限公司）、JN300-2型氮氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）、X1型高速離心機（香港基因有限公司）、FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）、HH-2型數顯恒溫水浴鍋（邦西儀器科技有限公司）、HC-100型制冷型恒溫混勻儀（北京昊諾斯科技有限公司）、DW-86L486型-80 ℃立式超低溫保存箱和BCD- 248WDPM型-20 ℃冰箱（青島海爾集團）等。

1.2 主要藥品與試劑

LGT-6對照品（批號20200804）由貴州醫科大學高等藥物化學重點實驗室合成，經高效液相色譜和核磁共振結構鑒定純度>99.0%;甲苯磺丁脲對照品（內標，批號HY-B0401-46070，純度>99.0%）購自美國MedChemExpress公司;透析袋（截留分子量8～14 kDa）購自北京蘭杰柯科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）購自北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，實驗用水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雌雄各半，12周齡，體質量為200～230 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（湘）2019- 0014。

1.4 血漿

健康人血漿（貨號PL030320T）由北京四正柏生物科技有限公司提供;猴血漿由美迪西普亞醫藥科技上海有限公司提供;大鼠血漿取自“1.3”項下SD大鼠。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

以ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以水（含0.01%甲酸）為流動相A、乙腈（含0.01%甲酸）為流動相B進行梯度洗脫（0～2 min，10%B;2～7 min，10%B→95%B;7～9 min，95%B;9～11 min，95%B→10%B，11～14 min，10%B）;流速為0.6 mL/min;柱溫為40 ℃;自動進樣器溫度為4 ℃;進樣量為2 μL。

離子源為電噴霧離子源，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃;采用多反應監測模式，采集模式為正離子模式;氣簾氣壓力為20 psi，霧化氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為60 psi;LGT-6的去簇電壓為134 V，碰撞電壓為34 V，入口電壓為10 V，碰撞室出口電壓為10 V，定量分析用離子對為m/z 487.0→434.3;內標的去簇電壓為70 V，碰撞電壓為18 V，入口電壓為10 V，碰撞室出口電壓為10 V，定量分析用離子對為m/z 271.1→172.0。

2.2 溶液的制備

精密稱取LGT-6對照品和內標對照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇0.2 mL使其溶解，再以PBS定容，搖勻，制成濃度均為100 μmol/L的LGT-6、內標貯備液。

2.3 大鼠血漿的采集

取SD大鼠12只，雌雄各半，于股動脈取血2 mL，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，于-80 ℃冷凍貯存，備用。

2.4 樣品處理

取透析內液（血漿樣品）與透析外液（PBS）各100 μL，分別置于EP管中，依次加入甲醇600 μL、內標貯備液100 μL，渦旋混勻后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，于37 ℃下用氮氣流吹干，殘渣加水400 μL、乙酸乙酯600 μL復溶，渦旋混勻，靜置分層后，取乙酸乙酯層，于37 ℃下用氮氣流吹干，殘渣再用甲醇100 μL復溶，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.1”項下條件進樣測定。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 分別取空白透析外液（PBS）和大鼠、猴、人空白血漿各適量，以甲醇替代內標，其余按“2.4”項下方法處理，制成空白透析外液樣品和大鼠、猴、人的空白血漿樣品（下同）。取LGT-6對照品和內標對照品各適量，以甲醇溶解稀釋制成LGT-6濃度為10 mmol/L、內標濃度為1 mmol/L的混合對照品溶液。將LGT-6濃度為300 nmol/L的PBS與人、猴和大鼠的空白血漿平衡48 h后，取透析內液按“2.4”項下方法處理，制成血漿樣品。將空白透析外液樣品、空白血漿樣品、混合對照品溶液、血漿樣品按“2.1”項下條件進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖2（因為人、猴與大鼠的空白血漿樣品、血漿樣品色譜圖基本一致，所以省略人和猴的血漿樣品色譜圖，以大鼠血漿樣品的色譜圖作為代表）。由圖2可見，LGT-6和內標色譜峰的峰形良好，保留時間分別約為7.5、8.7 min，血漿中的內源性物質和空白透析外液均不干擾LGT-6的分析測定，表明方法專屬性良好。

2.5.2 標準曲線繪制 精密量取“2.2”項下LGT-6貯備液，用PBS逐級稀釋制成濃度分別為18 000、6 000、2 000、600、200、60、20 nmol/L的系列樣品溶液。取上述系列樣品溶液各50 μL，分別加入大鼠、猴和人空白血漿950 μL，渦旋混勻。各取上述血漿樣品100 μL，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以LGT-6的濃度為橫坐標（c，nmol/L）、LGT-6與內標峰面積的比值為縱坐標（y），采用加權最小二乘法（加權系數為1/c）進行線性回歸。結果，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的回歸方程分別為y=1.28c+0.36（R 2=0.998 9）、y=1.09c+0.27（R 2=0.999 1）、y=1.32c+0.45（R 2=0.998 5），其檢測濃度的線性范圍均為1～900 nmol/L，定量下限均為1 nmol/L。

2.5.3 精密度與準確度試驗 按“2.5.2”項下方法制備LGT-6定量下限濃度（1 nmol/L）和低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質控樣品各6份，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積，考察日內精密度;連續測定5 d，考察日間精密度。以實測濃度與理論濃度的百分比考察準確度。結果，LGT-6定量下限濃度和低、中、高濃度質控樣品在大鼠、猴和人血漿中的日內、日間RSD均小于10%，準確度為90.46%～105.77%，符合生物樣品定量分析方法的相關要求[16]，詳見表1。

2.5.4 基質效應試驗 取大鼠、猴、人空白血漿各適量，按“2.4”項下方法處理后，加入相應濃度的LGT-6樣品溶液100 μL，制成LGT-6低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質控樣品各6份，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積（A1）。以甲醇為溶劑，配制與前者濃度對應的LGT-6對照品溶液各6份，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積（A2），按如下公式計算基質效應：基質效應=A1/A2×100%。結果，LGT-6低、中、高濃度質控樣品的基質效應均符合生物樣品定量分析方法的相關要求[16]，詳見表2。

2.5.5 穩定性試驗 按“2.5.2”項下方法制備LGT-6低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質控樣品，分別置于4 ℃下冷藏12 h、室溫（約20 ℃）下靜置12 h、反復凍融（4～37 ℃）3次后，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積。每樣品平行6份，考察其穩定性。結果，各質控樣品中LGT-6含量的RSD均小于10%，表明其在上述條件下穩定性良好，詳見表3。

2.5.6 稀釋可靠性考察 按“2.5.2”項下方法制備LGT-6濃度為3 600 nmol/L的標準血漿樣品，用PBS稀釋5倍至質控樣品濃度（720 nmol/L），每濃度平行6份。按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算LGT-6濃度，再計算準確度和精密度。結果，準確度為103.77%～105.27%，精密度RSD均小于10%，表明用PBS稀釋血漿樣品不影響血漿樣品的定量準確性，詳見表4。

2.6 平衡滲透實驗

2.6.1 透析袋吸附能力的測定 透析袋先用水浸泡1 h，再用20%乙醇浸泡20 min，結束后用水沖洗3次，于4 ℃保存，備用（透析袋處理方法下同）。參照文獻[17]方法確證透析袋的吸附能力：取空白血漿1.0 mL（V1）加入透析袋內，放入LGT-6濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L（c1）的PBS溶液（配制方法同“2.5.2”項）30 mL（V2）中，置于37 ℃恒溫培養箱中平衡，每濃度平行6份。取上述透析外液，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算藥物濃度（c2），并按如下公式計算吸附率：吸附率（%）=[c1×V1-c2×（V1+V2）]/（c1×V2）×100%。結果，透析袋對LGT-6的吸附率均不超過4%，表明該透析袋對LGT-6只有微量吸附，不會對測試造成顯著影響[16]，詳見表5。

2.6.2 平衡時間的確定 將處理后的透析袋一端結扎，朝袋中加入空白血漿1 mL，排除空氣后將另一端也結扎。將透析袋懸浮于裝有PBS溶液（其中LGT-6的濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L）30 mL 的廣口瓶中，放入37 ℃恒溫培養箱中進行透析，分別于4、8、12、24、48、72 h時取透析內液和透析外液，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算其中LGT-6濃度，并按如下公式計算血漿蛋白結合率：蛋白結合率（%）=（Dt-Df）/Dt×100%（式中，Dt為透析內液的藥物濃度;Df為透析外液的藥物濃度，即游離藥物濃度）。結果，平衡48 h時，LGT-6的血漿蛋白結合率與72 h時比較無明顯差異，說明48 h時透析已經達到平衡狀態，因此將平衡時間定為48 h，詳見表6。

2.6.3 藥物血漿蛋白結合率的測定 將處理后的透析袋一端結扎，朝袋中精密加入空白血漿1 mL，固定透析袋的另一端，使透析袋保持垂直且內有一定的空氣，再將透析袋懸浮于裝有PBS（其中LGT-6的濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L） 10 mL的平底玻璃管中，調節透析袋內、外液面，使兩者保持在同一平面上，并且確保透析袋不接觸管壁，最后將管口密封，在4 ℃下平衡靜置48 h。在透析結束后，精密量取透析內液和透析外液（先用10%的高氯酸溶液檢測是否有蛋白外漏，有外漏的樣品舍棄）各100 μL，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣測定5次，記錄峰面積，代入回歸方程計算其中LGT-6濃度。同時，考慮到LGT-6濃度為3 000 nmol/L的樣品濃度超出方法學線性濃度范圍，取3 000 nmol/L的樣品時，先用空白血漿或PBS稀釋5倍后，再同法處理、分析。各樣品中LGT-6蛋白結合率的計算同“2.6.2”項，結果見表7。

使用GraphPad Prism v 7.0軟件，對相同濃度下不同種屬和相同種屬下不同濃度LGT-6的血漿蛋白結合率進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。結果，在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結合率比較差異無統計學意義（P>0.05）;在相同種屬血漿中，不同濃度LGT-6的血漿蛋白結合率組間比較差異有統計學意義（P<0.05），且有隨著藥物濃度的升高而降低的趨勢。

3 討論

藥物由于受各種復雜多變的環境（例如酶、酸堿等條件）所影響，其血漿蛋白結合率會發生改變，導致藥物在體內的分布及消除發生改變，隨之影響靶組織中游離藥物的濃度，從而使藥物藥效及毒性發生變化[18]。因此，在新藥的開發階段進行血漿蛋白結合率的研究具有重要意義。目前，用于測定藥物血漿蛋白結合率的方法有很多，包括平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法、超速離心法和白蛋白微球測定法等，其中平衡透析法是較為經典、常用的方法[19]。該法操作簡單、吸附作用較小、干擾因素較少[19]，因此本研究選擇了平衡透析法。

本研究采用平衡透析法結合UPLC-MS/MS法測定4種不同濃度LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結合率。結果顯示，在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結合率沒有明顯差異，表明LGT-6與上述血漿蛋白的結合沒有明顯的種屬差異。在相同種屬血漿中，LGT-6與血漿蛋白的結合有隨濃度升高而降低的趨勢。其中，在低濃度時，其血漿蛋白結合率較高，表明低濃度LGT-6與DPP-4的結合呈現高親和性;隨著LGT-6濃度的升高，LGT-6與DPP-4的結合逐漸達到飽和，血漿中游離的LGT-6濃度隨著藥物濃度的增加而進一步增加，導致其在各種屬血漿中的蛋白結合率有所下降。此外，由于LGT-6在低濃度下有很強的血漿蛋白結合能力，因此，筆者在接下來的研究中需選擇在臨床有可能聯合應用的高血漿蛋白結合率藥物進行體外藥物競爭結合實驗，以考察其對LGT-6蛋白結合率的影響，保證臨床用藥安全。

綜上所述，本研究成功建立了測定LGT-6血漿蛋白結合率的方法。在相同的濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結合率沒有明顯的種屬差異，但有明顯的濃度依賴趨勢。

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（收稿日期：2021-02-04 修回日期：2021-05-26）

（編輯：鄒麗娟）