草果酚酸的提取工藝優(yōu)化

沈華 管紅梅 鐘燕 唐藝玲 胥鑫 代敏 蒲忠慧

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1698-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.06

摘 要 目的：優(yōu)化草果酚酸的提取工藝。方法：以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間為考察因素，原兒茶酚酸和香草酸的總含量為響應值，采用Box-Behnken設計-響應曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝并驗證。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)65%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時間2.5 h。經(jīng)3次實驗驗證，原兒茶酚酸和香草酸的平均總含量為12.32 mg/g（RSD=0.26%，n=3），與預測值（12.63 mg/g）的平均相對誤差為2.45%。結(jié)論：優(yōu)化所得工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 草果酚酸;提取工藝優(yōu)化;Box-Behnken設計-響應曲面法;原兒茶酚酸;香草酸

Optimization of the Extraction Technology of Phenolic Acid from Amomum tsaoko

SHEN Hua1，GUAN Hongmei1，ZHONG Yan1，TANG Yiling1，XU Xin1，DAI Min1，2，PU Zhonghui1，2，3（1. School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China; 2. Sichuan Engineering Laboratory for Prevention and Control of Veterinary Drug Residues in Animal Derived Food， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China; 3. Sichuan Key Laboratory of Development and Regeneration， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of phenolic acid from Amomum tsaoko. METHODS： The extraction technology of phenolic acid from A. tsaoko was optimized by using Box-Behnken design-response surface methodology with ethanol volume fraction， liquid-solid ratio and extraction time as factors， using the total contents of protocatechuic acid and vanillic acid as response value. The optimizd extraction technology was vlidated. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows： ethanol volume fraction 65%， liquid-solid ratio 4 ∶ 1 （mL/g）， extraction time 2.5 h. After 3 times of validation tests， average total content of protocatechuic acid and vanillic acid were 12.32 mg/g （RSD=0.26 %， n=3）， average relative error of which with predicted value （12.63 mg/g） was 2.45%. CONCLUSIONS： The optimal technology is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Phenolic acid from Amomum tsaoko; Extraction technology optimization; Box-Behnken design-response surface methodology; Protocatecholic acid; Vanillic acid

草果又名草果仁、草果子、老寇，始載于《寶慶本草折衷》[1]，為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果Amomum tsaoko Crevost et Lemaire的干燥成熟果實，主產(chǎn)于我國廣西、云南、四川、貴州等地。2020年版《中國藥典》（一部）記載，該藥氣香濃，味辛性溫，歸脾經(jīng)和胃經(jīng)，具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效，可用于治療寒濕內(nèi)阻、痞滿嘔吐、瘧疾寒熱、瘟疫發(fā)熱等癥[2]。草果作為藥食同源的大宗藥材，亦作為調(diào)味香料被廣泛用于食品行業(yè)[3]。

現(xiàn)代藥理研究表明，草果主要含有揮發(fā)油、黃酮類、酚酸類、甾體類、萜類和二苯庚烷類等成分[4-6]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)和防治疫病等作用[7-10]。但現(xiàn)有草果化學成分研究主要集中于揮發(fā)油部分[6]，而對于非揮發(fā)性成分的研究較少，質(zhì)量評價標準也尚未建立。有研究表明，草果中的草果酚酸類成分具有抗氧化、抗自由基的活性[10-11]，且該類成分中的原兒茶酚酸還具有抑菌、抗炎、抗氧化和保肝作用[12-13]，香草酸具有抑制酪氨酸酶活性、抗氧化應激等作用[14-15]。目前，對草果中原兒茶酚酸、香草酸的研究較少，其含量測定方法亦未見報道。為了更全面地評價草果的質(zhì)量并充分開發(fā)利用草果藥材資源，有必要對原兒茶酚酸和香草酸進行研究，旨在為草果非揮發(fā)性成分的深入研究提供依據(jù)。

Box-Behnken設計-響應曲面法能直觀反映各影響因素之間的交互關(guān)系，快速獲取最優(yōu)工藝各因素的水平，已被廣泛用于中藥提取工藝的優(yōu)化[16-18]。目前，尚未見采用該法優(yōu)化草果酚酸提取工藝的報道。基于此，在前期研究的基礎上[19-20]，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定草果提取物中原兒茶酚酸、香草酸的含量;同時以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間為考察因素，原兒茶酚酸和香草酸的總含量為響應值，采用Box-Behnken設計-響應曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝，旨在為草果的質(zhì)量標準完善及其后續(xù)的系統(tǒng)開發(fā)與應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent Infinity Ⅱ 1260型HPLC系統(tǒng)及配備的G7111A型高壓四元泵帶真空脫氣機、G7129A型自動進樣器、G7114A 1260 VWD型檢測器、LC-1260型2.4.0.628色譜工作站（美國Agilent公司），BI-800A型拜杰多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司），ME204型萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，IKA HB10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海萬捷科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

原兒茶酚酸對照品（批號DST191102-081，純度≥98%）、香草酸對照品（批號DST190706-088，純度≥98%）均購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，甲醇（美國Sigma公司）為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

草果藥材（批號20190920）購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，經(jīng)成都醫(yī)學院藥學院李羿教授鑒定為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果A. tsaoko Crevost et Lemaire的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 草果酚酸的提取

取草果藥材粉碎（過二號篩），精密稱取粉末10 g，置于圓底燒瓶中，按一定的液料比（5 ∶ 1，mL/g）加入65%乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5～2.5 h，濾過，合并濾液，濃縮蒸干得浸膏;浸膏加濃氨水充分溶解后濾過，濾液用濃鹽酸（36%～38%）調(diào)pH至2～3，再用乙酸乙酯萃取2次，每次120 mL，合并兩次乙酸乙酯萃取液，濃縮蒸干，即得草果酚酸粗品（每克粗品相當于草果生藥102.60 g）。

2.2 原兒茶酚酸和香草酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 以Eclipse Plus C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V）為流動相;流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃;檢測波長為272 nm;進樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酚酸、香草酸對照品各適量，分別置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度均為0.8 mg/mL的單一對照品溶液。量取上述各單一對照品溶液適量至同一棕色量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，制得原兒茶酚酸、香草酸質(zhì)量濃度分別為0.096、0.128 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項下草果酚酸粗品適量，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按“2.1”項下方法制備不含草果藥材的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制得陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，原兒茶酚酸、香草酸的保留時間分別約為5.1、11.9 min，分離度分別為10.00、2.53，理論板數(shù)分別為1 919、4 636;陰性對照對待測成分的測定無干擾，詳見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下各單一對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得相應質(zhì)量濃度的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分的進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果，原兒茶酚酸的回歸方程為Y=1 483.3X-81.705（r=0.999 5），香草酸的回歸方程為Y=3 182.3X-84.938（r=0.999 4）。表明，原兒茶酚酸和香草酸檢測進樣量的線性范圍均為0.16～1.60 μg。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.2”項下各單一對照品溶液0.5 mL，用甲醇稀釋40倍，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸峰面積的RSD分別為0.43%、0.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.1”項下草果酚酸粗品適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中原兒茶酚酸和香草酸的含量。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸含量的RSD分別為0.92%、0.41%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，原兒茶酚酸、香草酸峰面積的RSD分別為0.42%、1.42%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的草果酚酸粗品1 g，共9份，分別按已知量的50%、100%、150%加入質(zhì)量濃度均為0.032 mg/mL的原兒茶酚酸、香草酸單一對照品溶液（按“2.2.2”項下方法制備），按“2.2.3”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 精密稱取草果酚酸粗品粉末200 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中原兒茶酚酸、香草酸的含量，每樣品平行操作3次。

2.3 Box-Behnken設計-響應曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝

2.3.1 實驗設計與結(jié)果 前期預實驗發(fā)現(xiàn)，由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合實際工業(yè)生產(chǎn)，故確定提取次數(shù)為2次。而乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間對原兒茶酚酸、香草酸總含量的影響較明顯，故以乙醇體積分數(shù)（A，%）、液料比（B，mL/g）、提取時間（C，h）為考察因素，兩種成分的總含量為響應值，根據(jù)前期預實驗結(jié)果每因素設3個水平，共設計17次實驗（其中12次為析因?qū)嶒灒?次為中心點重復實驗）。草果酚酸提取工藝優(yōu)化的因素與水平見表2，實驗設計方案與結(jié)果見表3。

2.3.2 模型建立與方差分析 采用Design Expert 11.0軟件對表3中的總含量數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得二次多項回歸方程為Y=8.92+1.80A+0.33B+0.79C+1.37AB+0.075AC-0.88BC-2.76A 2+1.40B 2+0.98C 2。方差分析結(jié)果顯示，本模型的決定系數(shù)（R 2）為0.907 0，表明兩種成分總含量的變化有90.70%來源于所選的變量;整體模型差異性顯著（P=0.019 1<0.05），表明該模型用于草果酚酸提取工藝的優(yōu)化合理;本模型的失擬項不顯著（P=0.147 9>0.05），誤差導致模型擬合程度不佳的可能性較小，表明本模型可以對不同條件下的草果酚酸兩種成分總含量進行預測。各因素影響顯著性的順序為A>C>B;因素AB、AC、BC的影響不顯著（P>0.05），因素A 2的影響顯著（P<0.05），而因素B 2、C 2的影響不顯著（P>0.05），詳見表4。

2.3.3 響應曲面分析 為分析各影響因素之間的交互作用，快速得到最優(yōu)工藝各因素的具體水平，本研究采用Design Expert 11.0軟件繪制不同變量間交互作用的等高線圖和響應曲面圖。結(jié)果，因素A與因素B、因素A與因素C、因素B與因素C的交互作用均不顯著，與方差分析結(jié)果一致，詳見圖2。

2.3.4 最優(yōu)提取工藝的確定及驗證 采用Design Expert 11.0軟件得到最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)65.37%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時間2.5 h。考慮到實際操作，最終確定最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)65%，液料比4 ∶ 1（mL/g），提取時間2.5 h。在此最優(yōu)提取工藝條件下進行3次驗證實驗。結(jié)果，兩種成分的平均總含量為12.32 mg/g（RSD=0.26%，n=3），與預測值（12.63 mg/g）的平均相對誤差為2.45%，詳見表5。

3 討論

本課題組在前期預實驗中發(fā)現(xiàn)，較梯度洗脫，等度洗脫每次運行時的流動相比例相同，當檢測多個樣品時不需要設置平衡時間來讓系統(tǒng)恢復到所需的初始流動相比例[21]，故在結(jié)合分離效果的基礎上選擇等度洗脫。在此基礎上，本課題組結(jié)合相關(guān)文獻[22]，分別對定量HPLC法的流動相組成及比例、檢測波長、柱溫、流速進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在“2.2.1”項的色譜條件下，各成分的分離效果較好，該HPLC法的精密度、重復性、穩(wěn)定性均符合2020年版《中國藥典》（四部）要求[23]。含量測定結(jié)果顯示，草果提取物中原兒茶酚酸含量遠高于香草酸，前者約是后者的3～5倍，其原因有待進一步研究。

植物酚酸常用的提取方法有超臨界流體萃取、微波萃取和傳統(tǒng)溶劑提取等[24]。其中，超臨界流體萃取條件穩(wěn)定，無溶劑殘留，安全環(huán)保，但提取率較低、設備成本高;微波萃取提取率雖高，但生產(chǎn)成本相對較高;而傳統(tǒng)溶劑提取對設備要求低，且操作簡單、提取率穩(wěn)定，已被廣泛用于科研和實際生產(chǎn)中[25]。同時，由于酚酸類成分在植物體內(nèi)通常會與蛋白質(zhì)或多糖形成穩(wěn)定的復合物，因此有機溶劑和水的混合體系最適宜于酚酸類成分的提取，故本研究選擇乙醇為提取溶劑[26]。

本研究采用Box-Behnken設計-響應曲面法優(yōu)化草果酚酸的提取工藝，進行多元二次模型擬合，對各因素響應曲面進行三維、二維圖譜分析，以直觀反映各因素對原兒茶酚酸、香草酸含量的影響;同時，本研究充分考慮乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間之間的交互作用，以充分尋求優(yōu)勢區(qū)間范圍;最后，結(jié)合實際操作，最終確定最優(yōu)提取工藝是以4倍量（mL/g）的65%乙醇加熱回流提取2次，每次2.5 h。經(jīng)3次實驗驗證，所得提取物中原兒茶酚酸和香草酸的平均總含量為12.32 mg/g（RSD為0.26%），與預測值12.63 mg/g的平均相對誤差為2.45%，提示該方法穩(wěn)定、可行，模型預測性較好。

本研究采用HPLC法同時測定了草果酚酸中原兒茶酚酸和香草酸的含量，該方法專屬性好、準確度高;Box-Behnken設計-響應曲面法優(yōu)化所得的草果酚酸提取工藝穩(wěn)定、可行，可為該藥質(zhì)量控制方法的建立及活性部位的提取分離提供實驗基礎和科學依據(jù)。本課題組后期將進一步對草果酚酸進行更深入的研究，探究其藥效物質(zhì)基礎與作用機制，以推動草果資源及其制劑的進一步開發(fā)利用。

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（收稿日期：2021-02-24 修回日期：2021-06-14）

（編輯：陳 宏）