世界衛生組織《關于更新使用結核分枝桿菌及其耐藥性核酸擴增檢測技術的建議》的啟示

夏輝 趙雁林

快速、準確的實驗室診斷對于發現結核病患者、確定有效治療方案、獲取良好治療效果，以及阻止結核病在社區中的傳播至關重要。過去十幾年，結核病新診斷技術的研發取得了顯著進展,世界衛生組織已經推薦了若干新型結核病診斷技術。2021年2月 18日，世界衛生組織發布了《關于更新使用結核分枝桿菌及其耐藥性核酸擴增檢測技術的建議》(簡稱《建議》)(UpdateontheuseofnucleicacidamplificationteststodetectTBanddrug-resistantTB:rapidcommunication)[1]。此文件的發布與更新表明，在結核病及耐藥結核病的診斷領域又有了新的進展和更多可選擇的工具，在原來推薦的如多色半巢式熒光定量PCR、微流體芯片技術、環介導等溫擴增法、線性探針耐多藥及二線抗結核藥物耐藥性檢測技術等的基礎上[2]又提供了更多可選擇的技術和產品。這些技術和產品的實驗數據呈現出了較好的診斷效能，為進一步推廣應用帶來新的前景。筆者就世界衛生組織《建議》的產生背景、涉及技術的特征、性能指標，以及我國結核病防治規劃實施中相關領域需要關注的問題和啟示進行闡述，供業內人士參考。

一、背景

該文件在發布前通過系統綜述分析了目標技術或產品的技術指標和成本等，并根據PICO(PICO是基于循證醫學理論將信息格式化的檢索方式，為Participants, Interventions, Comparisons, Outcomes的縮寫)原則，確定技術指標(敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值)、用途、預期達到的目的，以及與其他檢查方法的可比性及區別等。由于在系統綜述過程中未查詢到所列技術的成本效果分析，該《建議》中描述的成本分析主要是基于前期類似技術已發表研究結果或單一儀器或試劑的成本。該《建議》的形成是通過全球專家組咨詢，并結合系統綜述中的技術指標、成本及操作簡易程度、可接受性、公平性、可獲得性等進行綜合判斷，最終給出應用建議。

二、推薦的產品技術

目前世界衛生組織結核病診斷評估機制是為了評估各類結核病診斷技術，不再針對特定產品。以前世界衛生組織在推薦使用各種產品和技術時往往是單個產品的推薦，主要是囿于當時可用的技術種類有限。隨著生物技術產品的日益增多，世界衛生組織不再推薦單一的、某一種特定產品，而是對技術進行了歸類，主要依據操作的復雜程度和手工操作步驟的多寡，將核酸擴增檢測技術(nucleic acid amplification tests， NAAT)進行了歸類，分別命名為低度復雜程度自動化核酸擴增檢測技術(low complexity automated NAAT))、中度復雜程度自動化核酸擴增檢測技術(moderate complexity automated NAAT)及高度復雜程度核酸雜交檢測技術(high complexity hybridization-based NAAT)。這些定義描述了技術的類型(如基于自動化的或雜交的NAAT)及操作的復雜程度(依據所需設施、設備及技術要求等區分低度、中度或高度復雜程度)。需要注意的是，該《建議》所列出的復雜程度僅作為指導這些技術產品具體應用時所考慮的其中一種因素，其他包括但不限于診斷準確性、應用地區的結核病及耐藥結核病流行病學特征、實施層面的因素(結果報告周期、檢測通量、現有檢驗設施和實驗室網絡等)、成本，以及技術的可接受性、公平性、終端應用的價值和用戶使用偏好等因素。

該《建議》內定義的低度復雜程度自動化核酸擴增檢測技術目前只納入了賽沛的Xpert MTB/XDR，該方法是基于10色熒光通道的多重PCR技術，需要注意的是Xpert MTB/XDR并不能直接使用原有的GeneXpert儀器平臺，需要對儀器核心模塊進行更新或者重新購買儀器。其完成檢測1份樣本約需90 min，需要手工操作的步驟非常少。此外，因世界衛生組織于2020年10月對廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的定義進行了修訂和更新[3]，準XDR-TB (Pre-XDR-TB)定義為滿足耐多藥/利福平耐藥結核病(MDR/RR-TB)且同時對任一氟喹諾酮類藥物耐藥，XDR-TB定義為滿足MDR/RR-TB且同時對任一氟喹諾酮類藥物耐藥并至少對其他A組抗結核藥物中的一種藥物耐藥。故使用Xpert MTB/XDR并不意味著可以檢測新定義下的XDR-TB患者，該方法目前也不能檢測貝達喹啉、利奈唑胺及其他可能歸入A組的藥物。

《建議》內定義的中度復雜程度自動化核酸擴增檢測技術目前包含4個平臺的產品，分別是雅培(RealTime MTB和RealTime MTB RIF/INH)、海恩生命科學(MTBDR和FluoroType MTB)、碧迪(MAXTMMDR-TB)和羅氏(MTB和MTB-RIF/INH)的產品技術。這些產品僅可用于診斷結核病、利福平及異煙肼耐藥。此處“中度復雜程度”主要依據涉及的自動化核酸提取、自動化PCR擴增、自動化結果讀取幾個步驟之間無需或只有1個移液步驟。在將檢測標本加入到試劑盒之前，此類“自動測試”僅需初始標本處理時的手工操作，開展此類技術的實驗室應滿足并采取一定的生物安全防護措施并配備特定設備，此外還需要訓練有素、操作熟練的實驗室人員來進行檢測并完成儀器維護要求等。 此類技術包含的4種產品雖均為自動化產品，但自動化程度及結果報告周期不盡相同，詳細對比情況見表1[4]。4種產品較之前世界衛生組織推薦的基于手工操作和人工判讀結果的線性探針技術在操作復雜性方面有了很大改進。

表1 中等復雜程度自動化核酸擴增檢測技術不同產品對比情況

高度復雜程度核酸擴增雜交檢測技術目前只包含了用于吡嗪酰胺耐藥診斷的尼普洛(日本)的Genoscholar PZA-TB Ⅱ方法。其操作與結果判讀與手工線性探針技術類似，操作繁瑣，人工操作步驟多，尤其是結果判讀完全依賴人工判讀，且因吡嗪酰胺耐藥相關基因pncA突變位點散布于整個基因，缺乏明顯的集中突變區域，故需要判讀的條帶多且復雜，因此結果判讀受人為因素影響較大。

本次世界衛生組織更新的《建議》雖根據復雜程度將不同的產品進行了大致的歸類，但每大類都包含了特定的診斷產品技術，不代表其他技術可以自動歸入相應的類別，任何新的同類別產品技術都需要開展具體評估后追加更新到相應的類別。

三、耐藥性檢測的藥物種類

現有的3種歸類法除了操作復雜程度外還區分了檢測技術的應用范圍，如對結核分枝桿菌和抗結核藥物耐藥性的檢測。原有的世界衛生組織推薦的技術如Xpert MTB/RIF雖然在全球應用最廣泛，但僅能檢測利福平耐藥性。線性探針技術既有針對利福平和異煙肼的檢測產品，也有針對氟喹諾酮類及二線注射類藥物的耐藥性檢測產品，但由于線性探針技術自動化程度較低，使得應用該技術的實驗室相對較少。

該《建議》中的低度復雜程度自動化核酸檢測技術Xpert MTB/XDR法可同時檢測異煙肼、氟喹諾酮類藥物、二線注射類藥物以及乙硫異煙胺相關的耐藥基因突變。中度復雜程度的自動化核酸擴增檢測技術目前仍僅針對結核分枝桿菌及對利福平和異煙肼的耐藥性檢測。高度復雜程度的Genoscholar PZA-TB Ⅱ僅可用于檢測吡嗪酰胺耐藥性，這也是目前唯一的一個用于檢測吡嗪酰胺耐藥性的分子生物學檢測技術。

四、三類技術的診斷效能

1． 低度復雜程度的自動化核酸擴增檢測技術診斷效能:包含3項研究的1605份樣本的系統綜述結果顯示，對在細菌學確診的肺結核患者，以表型藥物敏感性試驗為參考，在痰標本中檢測異煙肼耐藥的匯總敏感度為94.2%(95%CI：89.3%～97.0%)，匯總特異度為98.0%(95%CI：95.2%～99.2%)；檢測氟喹諾酮類藥物耐藥的匯總敏感度為93.1%(95%CI:88.0%～96.1%)，匯總特異度為98.3%(95%CI：94.5%～99.5%)；檢測阿米卡星耐藥的匯總敏感度為89.1%(95%CI：80.9%～94.1%)，匯總特異度為99.5%(95%CI：96.9%～99.9%)。因乙硫異煙胺的表型藥物敏感性試驗的準確性欠佳，故以inhA啟動子區測序作為檢測乙硫異煙胺耐藥性的參考標準，乙硫異煙胺耐藥檢測的匯總敏感度為96.4%(95%CI：92.2%～98.3%)，匯總特異度為100.0%(95%CI:82.5%～100.0%)。

2．中度復雜程度的自動化核酸擴增檢測技術診斷效能:包含32項研究的16 726份樣本的系統綜述結果顯示，以分離培養為標準，中度復雜程度的自動化核酸擴增檢測技術檢測結核分枝桿菌的匯總敏感度為93.0%(95%CI：90.9%～94.7%)，匯總特異度為97.7%(95%CI：95.6%～98.8%)。以表型藥物敏感性試驗為標準，檢測利福平耐藥的匯總敏感度為96.7%(95%CI：93.1%～98.4%)，匯總特異度為98.9%(95%CI：97.5%～99.5%)；檢測異煙肼耐藥的匯總敏感度為86.4%(95%CI：82.8%～89.3%)，匯總特異度為99.2%(95%CI：98.1%～99.7%)。

3．高度復雜程度的核酸擴增雜交檢測技術診斷效能：包含7項研究的964份樣本的系統綜述結果顯示，以表型藥物敏感性試驗為標準，細菌學確診肺結核患者分離株中，檢測吡嗪酰胺耐藥的匯總敏感度為81.2%(95%CI：75.4%～85.8%)，匯總特異度為97.8%(95%CI：96.5%～98.6%)。

五、對我國結核病防治的啟示

1．基于循證醫學證據結合廣泛代表性的專家論證是科學決策的有效方法：世界衛生組織的技術文件通常都是在系統文獻綜述的基礎上，召集有代表性的專家，根據PICO原則，確定相關指標，并基于循證醫學證據和專家論證意見，形成具有通用性和普遍性的技術推薦意見。基于循證醫學證據的科學決策方法值得我們學習和效仿，也需要在此基礎上，根據具體國情制定符合我國國情的技術措施和技術對策。

2．應用創新診斷工具是結核病精準診斷及治療的有效手段：由過去僅能檢測抗酸桿菌的涂片鏡檢發展到可以快速準確檢測結核分枝桿菌的分子生物學檢測技術，由僅能通過結果報告周期約2～3個月的表型藥物敏感性試驗到自動化針對多種藥物的分子生物學耐藥基因檢測，甚至是基因組學預測耐藥。結核病實驗室檢測技術的創新和進步推動了結核病的精準診斷和治療方案的選擇。《建議》中的低度復雜程度的Xpert MTB/XDR法可以快速、準確的提供除利福平之外其他幾種藥物的耐藥性檢測。該方法適用于縣(區)級應用，可以有效將耐藥結核病的診斷關口前移，對耐藥結核病的診斷及后續更加精準的治療產生促進作用。而異煙肼耐藥性結果的及時獲得可以準確診斷MDR-TB，而不是目前的以RR-TB替代MDR-TB。異煙肼敏感性的及時獲得對于我國預防性治療方案的選擇亦發揮作用。左氧氟沙星及莫西沙星作為MDR/RR-TB治療中的A類藥物，在組成有效治療方案及保護貝達喹啉等其他藥物發生獲得性耐藥中也發揮著作用[5-6]，乙硫異煙胺及吡嗪酰胺均歸類為治療MDR/RR-TB的C組藥物，在無法獲得其他藥品如貝達喹啉、德拉瑪尼、利奈唑胺時仍考慮使用[7]，故通過Xpert MTB/XDR-TB及快速、準確地獲得氟喹諾酮類及其他藥品耐藥結果，對于更加精準地制定治療方案十分有意義。精準及有效治療方案的組成有助于殺滅患者體內結核分枝桿菌，對于患者個體可以提高治愈率，對于人群而言有助于減少耐藥結核病的傳播。

《建議》中的低度復雜程度及中度復雜程度的自動化核酸擴增檢測技術將有助于其更快地在結核病防治規劃中的高質量擴展。

3.多種創新工具的出現需要因地施策和應用：世界衛生組織將在2021年更新的《結核病整合指南模塊3診斷-結核病快速檢測》中發布關于檢測結核病和耐藥結核病的核酸擴增檢測技術的最新政策指南。雖然《建議》中所列技術均未獲得我國相關部門的批準，我們也需要提前考慮如何有效地在結核病防治規劃中應用這些技術或同類技術，不同的地區可根據本地異煙肼及氟喹諾酮類藥物的耐藥率、疾病負擔、不同層級的實驗室能力及設施等制定適宜的策略。若兩種藥物的耐藥率較高，則迫切需要加強基于自動化核酸擴增檢測技術的廣泛應用，可以考慮在縣(區)級應用Xpert MTB/XDR。相反，若耐藥率低，則在經費有限的情況下短期內可維持現有診斷流程，即在地市級采用快速耐藥基因檢測方法檢測MDR/RR-TB，后續用表型藥物敏感性試驗方法檢測其他藥物耐藥。在地市級使用這些技術，仍然存在標本轉運延誤、診斷延誤、患者失訪等風險，因此要加強如標本轉運、患者管理、結果反饋等配套措施的建立和有效運行。但從結核病控制的角度，還是應盡快推廣應用這些自動化的核酸擴增耐藥檢測技術，盡可能提供快速準確的耐藥性診斷。

實施層面各地需要相應的政策支持，如各地物價的申請、醫保政策的支持等。對于使用Xpert MTB/RIF的地方，使用Xpert MTB/RIF時，除了試劑成本外，亦需要進行重新更換模塊及校準[8]。若引入新的中度復雜程度自動化核酸擴增檢測技術，需要新的設施、設備和試劑，實驗室人員和臨床醫生培訓，以及新的質量保證系統等。

4．開展基礎與實施性研究進一步創新和改善診斷工具：《建議》中的幾種技術雖在呼吸道樣本中顯示出較高的敏感度，但在不同國家、區域和不同臨床標本中的性能，在HIV感染者和兒童中的效能，在肺外樣本中的診斷效能尚未進行大范圍評估[9-10]，在我國更是缺乏相應研究和數據。

一些突變頻率較低的位點并沒有納入作為異煙肼及氟喹諾酮類藥物耐藥檢測的靶標序列[9，11]，可能在某些區域造成較低的敏感度。目前尚無基于分子生物學的貝達喹啉、德拉瑪尼等新藥的耐藥檢測技術，需要進一步開展基礎研究和應用型研究以創新及改善現有診斷工具。

中度復雜程度的4種產品迫切需要補充對其他藥物的耐藥性檢測。用于吡嗪酰胺耐藥檢測的高度復雜程度核酸擴增雜交技術的操作仍過于復雜，仍需提升自動化水平。

我國同等功能的技術，需要范圍更廣的評估和驗證，從而推動我國自主知識產權產品技術的進一步發展和應用。