核酸內切酶Surveyor酶切法快速檢測MTB對吡嗪酰胺耐藥性方法的建立及評估

胡嚴杰 龔世偉 任易

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作為常用的一線抗結核藥品[1-2]，能在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)，中性條件下以POA-的形式存在，一部分POA-通過外排作用轉運到細胞外，在酸性環(huán)境下，POA-被還原成不帶電荷的POA分子。由于POA的動態(tài)平衡，不帶電荷的分子再次被轉運到細胞內，因為POA進入細胞時帶一個質子，經過大量累積后使細胞質酸化，導致細菌死亡，從而發(fā)揮抗結核作用[3-5]。此外，PZA也可將治療周期從9～12個月縮短至6個月[6]。因此，成為結核病短程化療的基石。

PZase是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的pncA(561 bp)基因編碼的蛋白，PZase編碼基因及其啟動子序列的突變是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[7-8]，也是PZA耐藥的主要原因。PZase編碼基因及其啟動子序列的突變形式包括點突變、插入和缺失，可能發(fā)生突變的堿基幾乎覆蓋了整個基因，因此不便于應用常用的基于探針雜交的分子檢測技術。Surveyor酶是植物中提取的核酸內切酶，它可特異性切割DNA錯配部位，無特異酶切核苷酸序列，并已用于MTB乙胺丁醇耐藥基因突變的檢測[9]。本研究采用核酸內切酶Surveyor酶切法測定MTB對PZA耐藥性，并與BACTEC MGIT 960法檢測結果和基因測序結果進行對比，評估該方法的臨床應用價值。

材料和方法

一、菌株來源

MTB標準菌株H37Rv(ATCC27294)、PZA耐藥的MTB標準株BCG(ATCC 34540)，以及91株(選取106株，最終復蘇成功91株)耐多藥MTB菌株均來自武漢市肺科醫(yī)院。

二、 PCR擴增

50 μl PCR擴增體系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板分別來自H37Rv、BCG或91株耐多藥MTB臨床分離株，其中H37Rv擴增時上游引物∶下游引物分別為1∶1、5∶4、5∶3、5∶2；臨床株擴增時上游引物∶下游引物分別為1∶1、4∶5、3∶5、2∶5，最后加dd H2O補足至50 μl。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，PCR產物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、 DNA雜交

PCR結束后將標準菌株H37Rv的擴增產物和臨床分離株的擴增產物以1∶1的比例混合，95 ℃加熱10 min后，以2 ℃/s降溫至85 ℃，保持1 min。然后以0.3 ℃/s降溫至25 ℃。每隔10 ℃保持1 min。

四、 Survey酶酶切法

取20 μl雜交混合液，加入1 μl的Surveyor Enhaner S、1 μl的Surveyor Nuclease S和2 μl的0.15 mol/L的MgCl2?；靹蚝?2 ℃孵育1 h。取出后加入2.5 μl的終止液。

五、 BACTEC MGIT 960法檢測MTB對PZA耐藥性

使用BACTEC MGIT 960法檢測PZA的耐藥性，試劑由美國BD公司提供，并按照試劑盒說明書進行操作，其中接種0.5 ml菌懸液更改為0.25 ml，且PZA使用濃度為100 μg/ml。

六、 基因測序檢測MTB對PZA耐藥性

提取耐多藥MTB臨床分離菌株后進行PCR擴增，根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)獲取H37Rv的pcnA基因序列，設計并合成引物。上游：5′-GTCATGGACCCTATATCTGTGGCTGCCGC-GTCG-3′；下游：5′-TCAGGAGCTGCAAACCAA-CTCGACGCTGG-3′。50 μl PCR擴增體系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板，2 μl上游引物，2 μl下游引物，16 μl dd H2O。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，PCR產物4 ℃保存?zhèn)溆?。? μl的擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增是否成功，擴增產物送北京睿博興科生物技術有限公司進行純化及測序。從NCBI獲取H37Rv的pncA基因的堿基序列，使用Clone Manager 8.0軟件將所有的基因測序結果與標準基因堿基序列進行比對，找出突變位點及突變類型。

七、 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用百分比(%)表示。基因測序結果采用Clone Manager 8.0軟件進行分析。

結 果

一、核酸內切酶Surveyor酶切法檢測方法的建立

注 從左到右的加樣順序為：1～4孔為1∶1的H37Rv分別與2∶5、3∶5、4∶5、1∶1的BCG雜交后酶切，5～8孔為5∶4的H37Rv分別與BCG雜交后酶切，9～10、12～13孔為5∶3的H37Rv分別與BCG的雜交后酶切，14～17孔為5∶2的H37Rv分別與BCG的雜交后酶切，11孔為Marker，Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp圖1 核酸內切酶Surveyor酶切法檢測(引物配比摸索)電泳圖

圖1顯示，第13和14孔的產物條帶最亮，且區(qū)分度最高，其中第13孔是由5∶3(上游引物∶下游引物)H37Rv為模板的擴增產物與1∶1(上游引物∶下游引物)BCG臨床株為模板的擴增產物雜交后的酶切條帶，第14孔是由5∶2(上游引物∶下游引物)H37Rv為模板的產物與2∶5(上游引物∶下游引物)BCG為模板的產物雜交后的酶切條帶。兩者的雜交帶和酶切產物帶的亮度均較為接近，考慮到引物的使用，最終選擇上游引物∶下游引物為5∶2 擴增H37Rv，選擇上游引物∶下游引物為2∶5擴增臨床耐多藥MTB菌株來檢測臨床耐多藥MTB菌株的PZA耐藥性。

二、核酸內切酶Surveyor酶切法檢測MTB對PZA的耐藥性

當電泳圖上的酶切孔只有1條電泳條帶時判定其為野生型，即為敏感株；當電泳圖上的酶切孔有≥2條電泳條帶且與雜交孔條帶對比不一致時判定為突變株，即為耐藥株。如果電泳圖出現(xiàn)酶切孔有>2條電泳條帶且與雜交孔的條帶一致，則視為無效結果，需要重做。H37Rv電泳酶切孔只有1條電泳條帶，BCG雜交孔只有1條電泳條帶，酶切孔有3條電泳條帶，判定檢測結果有效(圖2，3)。

注 Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp(標準品為核酸內切酶Surveyor酶廠家提供)圖2 MTB標準品雜交條帶及酶切條帶電泳圖

注 從左至右1、3、5、7、11、13、15、17孔為酶切條帶，2、4、6、8、12、14、16、18孔為相對應的雜交條帶，9、19孔為Marker(10孔為無效孔，沒有點樣)，Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp。其中5、6孔為BCG，突變位點為168 bp處，7、8孔為H37Rv，10號孔為無效孔，1～2和3～4孔為突變菌株孔，突變位點分別為36 bp與488 bp處，13、14孔為無效結果孔，其余為無突變菌株孔圖3 MTB臨床株雜交條帶及酶切條帶電泳圖

三、以BACTEC MGIT 960法為對照分析核酸內切酶Surveyor酶切法的檢測效能

以BACTEC MGIT 960法為對照，核酸內切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株對PZA耐藥性的敏感度為100.0%(29/29)，特異度為87.1%(54/62)，準確度為91.2%(83/91)。

四、以基因測序結果為對照分析核酸內切酶Surveyor酶切法的檢測效能

以基因測序結果為對照，核酸內切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株pncA基因及其啟動子序列突變的敏感度為100.0%(37/37)，特異度為100.0%(54/54)，準確度為100.0%(91/91)。37株MTB突變株中29株經BACTEC MGIT 960法檢測為耐藥株，耐藥突變率為78.4%，54株野生株全部經BACTEC MGIT 960檢測為敏感株。

討 論

核酸內切酶Surveyor酶是一種特殊的核酸內切酶，它沒有特異酶切位點，但它可特異性識別和切割DNA錯配部位，因此核酸內切酶Surveyor酶切法不需要知道MTB的pncA及其啟動子區(qū)域的突變位置和類型，即可完成對其突變情況的檢測。而且該技術已經應用于其他疾病的基因突變檢測中[10-11]，但在結核病檢測方面應用較少。本研究以基因測序結果作為對照，共檢測了91株耐多藥MTB菌株的pncA基因及其啟動子序列的突變情況，與基因測序結果相比，核酸內切酶Surveyor酶切法檢測的敏感度、特異度及準確度均為100.0%，且其酶切條帶大小與突變位置基本一致。張霞等[9]的研究顯示，使用核酸內切酶Surveyor酶檢測線粒體基因相關突變時能檢測出使用基因測序檢測時檢測出的突變位點，還能檢測出未知的突變位點；同時Shi等[12]使用核酸內切酶Surveyor酶法檢測MTB對乙胺丁醇耐藥相關基因的突變，其與基因測序相比的一致率也高達100%，本研究的結果與張霞等[9]、Shi等[12]的結果一致；同時本研究的突變位點控制在可知的范圍內，因此，核酸內切酶Surveyor酶切法能夠有效檢測出MTB的pncA基因突變情況。核酸內切酶Surveyor酶切法與基因測序的一致率高達100%，可為MTB的pncA及其啟動子序列突變檢測提供新的思路。

此外，本研究以BACTEC MGIT 960法為對照，核酸內切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株PZA耐藥性的敏感度為100.0%，特異度為87.1%，準確度為91.2%。Shi等[12]使用核酸內切酶Surveyor酶切10株MTB臨床分離株的pncA基因，并與該菌株的PZase活性進行比較，其敏感度、特異度及準確度分別為100.0%、66.7%及88.9%。本研究與其相比特異度差異較大，可能是因為Shi等[12]選擇的菌株較少，且僅有2株敏感株。雖然本研究及Shi等的研究都獲得了100%的敏感度，但BACTEC MGIT 960法判定的PZA耐藥菌株中大約有90%左右的菌株發(fā)生了pncA及啟動子序列的基因突變[13-14]，因此，本研究獲得的100%敏感度與抽樣誤差有關。

本研究中37株MTB突變株檢測出29株耐藥株，耐藥突變率為78.4%，54株野生株全部為敏感株。與Ramirez-Busby和Valafar[8]的Meta分析結果稍有不一致，可能與本研究選擇的樣本量較少有關。而37株MTB突變株中有8株為BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法鑒定的敏感株，進一步說明了MTB對PZA耐藥性與pncA基因的突變高度相關，同時還可能存在其他的MTB菌株對PZA耐藥的機制[15]。此外，MTB菌株發(fā)生突變但不耐藥的原因可能是因為pncA及其啟動子序列的突變只引起了很低的PZase活性的降低，導致很低程度的PZA耐藥。這種降低沒有達到表型藥物敏感性試驗可檢測出的程度，而且這種程度的耐藥可能不會引起臨床問題。

綜上，核酸內切酶Surveyor酶切法檢測MTB的pncA基因及其啟動子序列突變的性能與基因測序高度一致。雖然核酸內切酶Surveyor酶切法具有快速、操作簡便、價格低廉的特點，可以在沒有基因測序條件的地區(qū)作為MTB對PZA耐藥檢測的備選方案。但該方法不能夠判斷結果中的突變類型，不能有效區(qū)分同義突變和錯義突變，不能對該部分造成的假陽性結果進行有效的區(qū)分；同時本研究的標本量有限，結果還需要更多的標本驗證。