GeneXpert MTB/RIF檢測技術在煤工塵肺并發肺結核患者中的診斷價值

楊曉麗 何兵 王皎磊 張云云 張春霞 李月 李建軍 史文韜

2019年全國共報告職業性塵肺病患者15 898例[1]。塵肺病是致殘性疾病,主要是肺組織廣泛纖維化引起心肺功能損傷,致使患者勞動能力下降[2]。煤工塵肺是指煤礦工人長期吸入生產性粉塵所引起的塵肺的總稱。在煤礦開采過程中由于工種不同，工人可分別接觸煤塵、煤矽塵和矽塵，從而引起肺的彌漫性纖維化，統稱為煤工塵肺[3]。煤工塵肺是嚴重危害煤礦職工身體健康的主要職業病，煤工塵肺患者是肺結核的好發人群，肺結核是塵肺患者的主要直接死因之一[4]。目前，煤工塵肺并發肺結核的主要診斷依據是胸部X線攝片(簡稱“胸片”)和痰液結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的檢查。由于矽肺患者胸片檢查結果的多變性和不確定性，使痰液MTB檢查結果成為矽肺患MTB感染和結核病復發確診的直接病原學證據[5]。

肺結核的診斷主要依靠痰涂片抗酸染色和痰分枝桿菌培養。我國常規應用的結核病實驗室診斷方法，如涂片顯微鏡檢查，敏感度較低；痰培養具有較高的敏感度，但耗時較長。現有的結核病實驗室診斷標準均不能滿足臨床早期、快速診治的需要，可能延誤診斷和治療，開發敏感度高、耗時短、成本低廉并易普及的檢測方法成為大勢所趨[6]。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測技術是一種操作簡便、快速、敏感度和特異度高、對操作人員安全的重要方法[7]。同時，Xpert技術能同時檢測利福平耐藥情況，并能提高低含菌量標本的檢出率，可更好地輔助臨床醫生及早診療和及時預防隔離[8]。本研究采用Xpert檢測技術對煤工塵肺并發肺結核患者的晨痰進行檢測，觀察其在煤工塵肺并發肺結核患者中的診斷價值。

資料和方法

一、 研究對象

選取2019年1月至2020年12月在北京京煤集團總醫院診治的64例煤工塵肺并發肺結核患者作為研究對象；均為男性，年齡39～87歲，中位年齡66歲。塵肺病診斷依據《GBZ 70—2015 中華人民共和國國家職業衛生標準》[9]進行，結核病診斷依據《WS 196—2017 結核病分類》[10]和 《WS 288—2017 肺結核診斷》[11]進行診斷。留取患者晨起合格痰標本3～5 ml，各取1 ml分別加入到3個前處理管中，分別進行痰抗酸桿菌涂片、痰分枝桿菌培養、Xpert檢測。

二、 試驗材料

分枝桿菌涂片鏡檢采用萋尼染色方法，購自珠海貝索生物技術有限公司，培養采用BACTEC MGIT 960液體培養(簡稱“MGIT 960培養”)系統，由美國BD公司生產。Xpert檢測系統及其配套試劑盒(Cartrige 反應盒)購自美國Cepheid公司，產品技術編號為國械注進20173406215。

三、 Xpert檢測方法

取1 ml痰標本放入前處理管中，加入相當于痰標本體積兩倍的SR痰標本處理液中，將前處理管置于漩渦振蕩器上振蕩20 s左右，直到無可見塊狀痰標本為止，靜置15 min，用試劑盒中的無菌吸管取2 ml液化后的樣品由加樣孔緩慢轉移到Cartridge反應試劑盒中，然后將Cartridge反應試劑盒放入檢測模塊中，儀器進行自動化檢測，2 h后儀器自動判讀出結果、含菌量及是否對利福平耐藥。如果6條探針中，除質控探針外有≥2條探針發出熒光，則提示MTB感染，根據Ct值的不同可對MTB濃度進行高(Ct值<16)、中(16≤Ct值<22)、低(22≤Ct值≤28)判定。5條探針如果未全部發出熒光，則說明對利福平耐藥。

四、 統計學處理

建立Excel數據庫收集數據，采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，組間陽性檢出率的比較及不同檢測方法間的敏感度、特異度、一致率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。本研究的各項指標相關定義如下：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%,特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%,陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%,陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。各方法間的一致性檢測采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75，說明兩種方法診斷一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75說明兩種方法診斷一致性中等；Kappa值<0.4，說明兩種方法診斷一致性較差。同時，分別繪制兩種技術結核病診斷的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，根據ROC曲線下的面積(AUC值)評價診斷結果的準確性。

結 果

一、以MGIT 960培養為金標準，比較Xpert檢測與痰涂片法對MTB的檢測效能

MGIT 960培養陽性患者18例，涂片陽性患者6例，Xpert檢測陽性患者28例。以MGIT 960培養法為金標準，涂片法與Xpert檢測對病例組患者MTB檢測的敏感度分別為27.8%(5/18)、88.9%(16/18)；特異度分別為97.8%(45/46)、73.9%(34/46)；陽性預測值分別為5/6、57.1%(16/28)，陰性預測值分別為77.6%(45/58)、94.4%(34/36)。兩種方法的一致率均為78.1%。Xpert檢測敏感度高于涂片法，差異有統計學意義(χ2=13.829，P=0.000)；涂片法特異度高于Xpert檢測，差異有統計學意義(χ2=10.839，P=0.001)。Xpert檢測的失敗率和污染率均為0。

二、痰涂片與Xpert檢測結果一致性分析

Xpert檢測與MGIT 960培養一致性為78.1%(50/64)(Kappa=0.537)，兩者具有中等一致性。痰涂片與MGIT960培養一致性為78.1%(50/64)(Kappa=0.321)。對于涂陰煤工塵肺并發肺結核患者，Xpert檢測的陽性率為36.2%(21/58)；MGIT 960培養陰性的46例患者中，Xpert檢測MTB陽性率為21.7%(10/46)，涂片陽性率為2.2%(1/46)，兩種檢測方法比較差異有統計學意義(χ2=8.364，P=0.004)。Xpert 檢測與痰涂片檢測的AUC值分別為0.836、0.628(圖1)。

圖1 Xpert MTB/RIF檢測與痰涂片檢測煤工塵肺并發肺結核的ROC曲線

三、兩種方法檢測煤工塵肺并發肺結核患者對利福平耐藥情況

64例患者的痰標本均進行MGIT 960培養，共得到18例分枝桿菌陽性菌株，經菌種初步鑒定，均為MTB。MGIT 960藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)與Xpert檢測分別有4例和7例耐利福平。以MGIT 960藥敏試驗結果為標準，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為100.0%，特異度為78.6%，陽性預測值為57.1%，陰性預測值為100.0%，一致性為83.3%，兩種方法檢測利福平耐藥的差異有統計學意義(χ2=4.889，P=0.027)。兩種檢測方法的Kappa值為0.620，兩者具有中等一致性(表1)。

表1 以MGIT 960藥敏試驗為標準評價Xpert對兩組患者利福平耐藥性的檢測效能

討 論

Mirsadraee等[12]對伊朗和韓國1980—2011年間報道的6280例煤工塵肺患者進行Meta分析，發現22.5%并發肺結核，明顯高于非塵肺對照組。矽肺并發肺結核患者痰中變異的L型MTB、抗酸染色呈陰性及肺部嚴重纖維化、支氣管扭曲變形致痰液引流不暢均可造成結核病的漏檢及誤診[13]。

Xpert檢測是基于定量PCR的分子生物學檢測，能夠從已經滅活的MTB中擴增出MTB核酸并報告診斷，可出現痰培養陰性而Xpert檢出陽性的情況。本研究中，液體培養陰性的46例患者中，Xpert檢測MTB陽性患者10例(21.7%)，涂片陽性1例(2.2%)，兩種檢測方法比較差異有統計學意義。Xpert能檢測出MTB含量較低的標本，可提高低含菌量標本的陽性率。對于涂陰煤工塵肺并發肺結核患者，Xpert檢測的陽性率為36.2%，這些患者無法通過痰涂片檢測MTB進行診斷，容易漏診。因此，Xpert檢測可以明確診斷，早診斷、早治療，避免誤診誤治。

本研究中Xpert檢測在煤工塵肺并發肺結核患者中的敏感度(88.9%)、陰性預測值(94.4%)均較高，而特異度、陽性預測值相對較低。Xpert檢測因其簡便、快速、敏感度高且能同時檢測利福平耐藥菌株等優點，在臨床結核病篩查診斷中具有較好的應用價值[14]。Steingart等[15]報道，Xpert檢測總敏感度為89%，對涂片陽性樣本，敏感度達98%，對涂片鏡檢陰性的標本敏感度為67%，總特異度為99%。Pimkina等[16]報道，Xpert 檢測對培養陽性患者敏感度為93.7%，特異度為91.7%，對于涂片陰性樣本的敏感度為82.5%。本研究Xpert 檢測敏感度與上述研究基本相似，但特異度均低于上述結果。周銀發等[17]研究以痰固體培養為標準， Xpert檢測MTB的敏感度與陰性預測值均較高，但特異度與陽性預測值均較低，兩種檢測方法的結果呈中度一致。也有文獻顯示，以傳統固體痰培養為金標準，在涂陰疑似肺結核患者中Xpert檢測MTB的敏感度為55.2%～90.2%[18]。本文結果與這兩項研究相符。分析原因可能為：(1)標本菌量太低，超出Xpert檢測的下限；(2)可能存在PCR抑制因子；(3)樣本量較少；(4)考慮與實驗方法、研究對象自身局限性有關，矽肺患者由于全身免疫力和防御機能的下降，加之二氧化硅對MTB活力和毒性的增強作用，同時，肺組織的缺血和缺氧等因素不利于MTB的生長，其肺內長期生存的MTB可產生適應性改變，在形態、毒力、抗原性及藥物敏感性方面發生變異[19]。Xpert檢測結果一致性及ROC曲線下面積均優于痰涂片。相較于傳統實驗室診斷方法，Xpert對煤工塵肺并發肺結核診斷的準確性高，且極大地縮短了檢測時間。

以MGIT 960藥敏試驗結果為標準，煤工塵肺并發肺結核患者Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為100.0%，特異度為78.6%。張治國等[20]研究顯示，以傳統藥敏試驗為金標準，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為 89.1%，特異度為 96.3%。Boehme等[21]研究顯示Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為 97.6%，特異度為 98.1%，特異度均高于本研究。在煤工塵肺并發肺結核患者中，兩種方法檢測利福平耐藥差異有統計學意義；當然，關于Xpert檢測的假耐藥性問題也不容忽視，目前已升級至G4版本，以提高耐藥檢測的特異度。但最近研究報道，Xpert檢測的假耐藥患者，給予一線抗結核藥物后可成功治愈，提示目前仍未解決假耐藥性問題[22-24]。

本研究中，在痰涂片、液體培養檢測為陰性的患者中仍有患者核酸檢測陽性，且對這些患者進行重復試驗均為陽性，充分印證了在煤工塵肺并發肺結核患者的輔助診斷中核酸檢測的高敏感度。有30%～60%的肺結核患者無細菌學依據[25]，導致涂陰肺結核患者誤診誤治，其病亡率接近20%[26]。結核病的早期診斷及其耐藥性的檢測，對于很好地控制耐藥結核病的傳播具有十分重要的意義[20]。由于部分非結核分枝桿菌中也存在rpoB基因或類似基因，故理論上Xpert檢測有假陽性的可能，但有報道顯示[15]，非結核分枝桿菌造成假陽性的比例僅為0.6%。WHO進一步更新了推薦，認為Xpert檢測可作為涂陰肺結核患者進一步明確結核病診斷的后續檢測方法[27]。

綜上所述，Xpert檢測是一種速度快、敏感度高的MTB感染的輔助診斷方法，在煤工塵肺并發肺結核患者中具有較高的臨床應用價值，Xpert檢測可作為臨床快速檢測MTB及其利福平耐藥性的篩選試驗。在一些結核病基層醫療機構，一定程度能降低漏診率，使患者盡早進行有效抗結核治療，減少煤工塵肺與結核病對機體造成的協同損害作用，從而減少患者痛苦，降低患者病亡率。