明膠通過NF-κB信號通路促進RAW264.7細胞形成多細胞聚集體和釋放促炎性因子

朱 濤,毛金磊,劉怡鳴,趙葉利

(溫州醫科大學藥學院,中國浙江溫州325035)

細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在維持機體內環境穩態中起著至關重要的作用,為細胞的生存以及活動提供適宜的場所,同時也可影響細胞的形狀以及增殖、遷移和分化等功能。正常情況下,細胞外基質的合成和降解維持在一個動態平衡[1～2]。一旦這種平衡遭到破壞,就會引起各種各樣的疾病,如組織纖維化、炎性疾病甚至癌癥[3～4]。因此,維持細胞外基質合成和降解的動態平衡,對機體的生命活動至關重要。

膠原(collagen)作為細胞外基質的主要成分以及機體內含量最豐富的蛋白質,在維持機體內環境穩態中起著重要的作用。有研究發現,在機體發生病變或組織重構時,如皮膚創傷或燒傷,膠原會分解或者變性成明膠(gelatin)[5]。同時,機體免疫細胞(如巨噬細胞)會被激活并募集到病變部位釋放大量的炎性因子,從而影響疾病的發展進程[6]。膠原的片段能夠通過介導促炎性細胞因子的釋放影響炎癥反應[7]。變性的膠原通過結構同源性模仿白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8),從而介導炎癥反應[8]。研究報道,在不同的培養條件下,膠原片段增加或抑制IL-1β的生成[9～10]。明膠作為膠原的降解或變性產物,目前主要用于藥物遞送和醫藥行業[11～12]。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為研究對象,考察明膠對巨噬細胞的影響,以探索明膠在介導機體炎癥反應中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

RAW264.7細胞(中國科學院上海細胞庫);PDTC(pyrrolidinedithiocarbamic acid)和甲基噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma公司,美國);DMEM培養液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司,美國);明膠(Nippi公司,日本);ELISA試劑盒(達科為生物技術股份有限公司);RIPA裂解液和BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術研究所);核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抗體和山羊抗兔二抗(CST公司,美國)。

1.2 RAW264.7細胞的培養

將RAW264.7細胞置于含有10%FBS、100U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中,于37℃、5%CO2培養箱中培養。采用對數生長期的細胞進行所有的實驗。

1.3 明膠包被培養

用0.5 mmol/L冰醋酸將明膠稀釋成1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL等不同質量濃度,將配置好的明膠沿側壁緩慢地加入到6孔板中,搖勻,放置于37℃培養箱孵育過夜。細胞接種前,棄掉明膠包被液后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)輕輕洗滌6孔板表面,最后將細胞埋于有明膠包被培養的6孔板中進行培養。如果細胞給予抑制劑處理,抑制劑需要與細胞同時接種于明膠包被的培養板上培養。

1.4 實驗分組

實驗分為4組,即空白對照組(control):未包被明膠培養的細胞;明膠組(gelatin):1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL等不同質量濃度的明膠包被培養細胞;NF-κB抑制劑和明膠共處理組:NF-κB抑制劑PDTC(5 μmol/L)與細胞同時培養在明膠(10 mg/mL)包被的6孔板上24 h;NF-κB抑制劑組:PDTC處理未包被明膠培養的細胞。實驗重復3次。

1.5 形態學觀察

取對數期生長的RAW264.7細胞,胰酶消化后離心,以4×105個/孔的密度接種到明膠包被的6孔板中培養到對應時間點,倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。

1.6 細胞存活率檢測

細胞經明膠包被培養不同時間點后,加入0.5 mg/mL的MTT溶液 20 μL,于37℃條件下孵育3 h;隨后加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、異丁醇和HCl組成的三聯溶液孵育過夜。三聯溶液配制:SDS 10 g,異丁醇5 mL,10 mol/L HCl 0.1 mL,用雙蒸水配成100 mL溶液。最后,使用酶標儀檢測在570 nm波長下的光密度(A)。細胞活力計算公式如下:細胞存活率(%)=(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100%。

1.7 促炎性因子的檢測

用10 mg/mL明膠包被培養RAW264.7細胞24 h,收集細胞培養液,根據ELISA試劑盒說明書檢測培養液中的IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

1.8 蛋白質印跡法

處理后的細胞樣品用RIPA裂解液裂解1 h,4°C條件下12×103g離心10 min后收集上清液,用BCA蛋白試劑盒進行蛋白質定量。使用10%SDS-PAGE進行電泳以分離蛋白質,接著把分離在膠中的蛋白質轉印到PVDF膜上(250 mA,轉印1.5 h)。PVDF膜使用前需放在甲醇中浸泡15 s以活化膜表面的陽離子。蛋白質轉印至PVDF膜后,使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,隨后用NF-κB抗體(1∶1 000)4°C孵育過夜,TBST洗3次,每次10 min,再用辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次10 min。將ECL發光液均勻涂于膜上,最后將蛋白質印記呈現于底片上,底片購買于ThermoFisher Scientific公司(Rockford,USA)。

1.9 統計學分析

用SPSS 19.0(Statistics Package for Social S-cience,SPSS,Chicago,IL)統計軟件進行數據的處理和分析。采用單因素方差分析(ANOVA),不同組間選擇方差齊性檢驗下的LSD檢驗進行統計學差異分析。數據均用平均值±標準差(±s)表示。P<0.05被認為在統計學上具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 明膠包被培養促進RAW264.7細胞形成多細胞聚集體

為了考察明膠包被培養對RAW264.7細胞的形態是否有影響,采用10 mg/mL明膠包被培養細胞24 h。相差顯微鏡觀察發現,明膠包被培養方式下,RAW264.7細胞形成多細胞聚集體,并從培養板脫離,懸浮于培養液中(圖1)。

圖1 明膠對RAW264.7細胞的形態學影響相差顯微鏡觀察拍照(標尺:100 μm)。Fig.1 Effect of gelatin on morphology of RAW264.7 cellsThe images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).

2.2 明膠以濃度和時間依賴性的方式促進多細胞聚集體的形成

為了考察多細胞聚集體的大小是否與明膠濃度和作用時間有關,采用不同質量濃度明膠包被培養細胞24 h,結果發現細胞多聚體的大小隨著明膠質量濃度的增加而增大(圖2A)。而且,當RAW264.7細胞在10 mg/mL明膠上培養12 h、24 h、36 h和48 h時,細胞聚集體的大小隨時間延長而增加(圖2B)。這些結果說明,明膠誘導RAW264.7細胞形成多細胞聚集體具有一定的濃度和時間依賴性。我們后續實驗采用10 mg/mL明膠培養24 h。

為了考察傳統培養對多細胞聚集體的影響,將用不同質量濃度的明膠包被培養24 h的細胞轉移到未包被明膠的培養板中,結果發現,當多細胞聚集體重新培養到未包被明膠的培養板上時,這些多細胞聚集體解離并重新貼壁生長(圖2C)。

圖2 明膠以濃度和時間依賴性的方式促進多細胞聚集體的形成(A)不同質量濃度明膠培養RWA264.7細胞24 h;(B)10 mg/mL明膠培養12 h、24 h、36 h和48 h;(C)未包被明膠的培養板促進多細胞聚集體解聚并貼壁生長。相差顯微鏡觀察拍照(標尺:100 μm)。Fig.2 Gelatin induced the aggregate formation of RAW264.7 cells in a concentration-and time-dependent manner(A)Cell culture on plates coated with different concentrations of gelatin solution for 24 h;(B)Cell culture on 10 mg/mL gelatin for different incubation times;(C)Cell culture on plates without gelatin coating(the cell aggregate disaggregated and grew adhering to the wall).All the images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).

2.3 明膠對RAW264.7細胞存活率的影響

為了考察細胞聚集是否影響RAW264.7細胞的存活率,采用不同質量濃度的明膠分別培養細胞24 h和48 h,用MTT法檢測細胞的存活情況。結果顯示,不同質量濃度明膠包被培養不同時間下,RAW264.7細胞形成的多細胞聚集不影響細胞的存活(圖 3)。

圖3 明膠不影響RAW264.7細胞的存活率采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的處理和分析。數據均用平均值±標準差(±s)表示,實驗重復3次。Fig.3 Gelatin did not influence the viability of RAW-264.7 cellsData are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.

2.4 明膠包被培養促進RAW264.7細胞釋放促炎性細胞因子

在皮膚燒傷等病理環境下,膠原會變性成明膠,同時誘導炎癥級聯反應的發生。我們猜想炎癥反應是否與明膠大量生成有關。因此,將RAW264.7細胞用10 mg/mL明膠包被培養24 h,檢測培養液中IL-1β和TNF-α的水平。結果發現,明膠包被培養促進RAW264.7細胞生成IL-1β和TNF-α(圖4)。這提示明膠的大量生成可介導機體炎癥反應的發生。

圖4 明膠包被培養促進RAW264.7細胞生成促炎性細胞因子采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的處理和分析。數據均用平均值±標準差(±s)表示,實驗重復3次。*P<0.05,**P<0.01,與control組相比。Fig.4 Gelatin-coated plates promoted production of proinflammatory cytokines in RAW264.7 cellsData are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.*P<0.05,**P<0.01 versus the control group.

2.5 明膠通過NF-κB促進多細胞聚集體的形成和促炎性細胞因子的釋放

NF-κB作為參與炎癥反應的轉錄因子,可以誘導促炎細胞因子的產生。我們猜想NF-κB是否在明膠促進促炎性細胞因子中發揮重要作用。基于此,我們首先通過蛋白質印跡法考察了明膠對RAW264.7細胞中NF-κB蛋白表達的影響,結果顯示,明膠(10 mg/mL)顯著上調NF-κB蛋白的表達(圖5A)。隨后,采用NF-κB抑制劑PDTC處理細胞,結果發現,明膠促進RAW264.7細胞釋放IL-1β和TNF-α,但PDTC的處理顯著逆轉了此作用(圖5B～C)。為了進一步考察NF-κB是否調控細胞多聚體的形成,我們觀察了PDTC處理后細胞的形態,發現PDTC能夠抑制細胞多聚體的形成(圖5D)。這些結果說明,明膠通過NF-κB介導細胞聚集和促炎因子的生成。

圖5 明膠通過NF-κB促進多細胞聚集體的形成和促炎性細胞因子的釋放(A)明膠包被培養上調RAW264.7細胞中NF-κB蛋白的表達;(B)PDTC處理可抑制明膠對IL-1β生成的促進作用;(C)PDTC處理可抑制明膠對TNF-α生成的促進作用;(D)PDTC處理抑制了明膠對細胞多聚體形成的促進作用。相差顯微鏡觀察拍照(標尺:100 μm)。采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的處理和分析。數據均用平均值±標準差(±s)表示,實驗重復3次。***P<0.001,與control組相比;##P<0.01,###P<0.001,與gelatin組相比。Fig.5 Gelatin acted on RAW264.7 cells through NF-κB signaling pathway(A)Gelatin increased the expression of NF-κB protein in RAW264.7 cells;(B)Increased release of IL-1β in RAW264.7 cells cultured on a gelatin-coated plate was reversed by PDTC treatment;(C)TNF-α production increased by gelatin was inhibited by PDTC treatment;(D)Cell aggregation promoted by gelatin was suppressed by PDTC treament.All the images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).Data are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.***P<0.001 versus the control group;##P<0.01,###P<0.001 versus the gelatin-coated group.

3 討論

細胞外基質作為維持細胞微環境穩態的重要組成部分,其成分的改變會導致細胞行為和功能發生異常,從而誘導組織纖維化、慢性炎癥以及癌癥等多種疾病的發生[4]。膠原是機體內含量最豐富的蛋白質。皮膚創傷或燒傷會導致膠原降解或變性成明膠。同時,皮膚燒傷會激活并募集巨噬細胞遷移到炎癥部位,釋放大量的促炎因子[13～14]。這提示明膠在疾病的發生發展過程中發揮著重要的作用。因此,研究明膠對免疫細胞的影響,對更好地探究細胞外基質成分改變在疾病發展中的作用具有深遠意義。

有研究發現,慢性銀屑病皮膚炎癥可誘導單核細胞聚集[15]。本研究發現,明膠包被培養促進RAW264.7細胞形成多細胞聚集體,同時對細胞的存活無影響(圖1和圖3)。膠原釋放的片段可誘導炎癥反應[7]。我們的研究結果顯示,明膠能夠促進RAW264.7細胞釋放IL-1β和 TNF-α (圖4)。NF-κB可介導促炎因子的表達[16],本研究發現明膠可通過NF-κB促進促炎因子的釋放(圖5)。免疫細胞在炎癥過程中起著關鍵的作用。這提示膠原的變性或降解產物可能通過影響免疫細胞的行為和功能介導炎癥反應。炎性細胞募集到損傷部位后可產生大量活性氧,同時分泌炎性介質,從而導致基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的過度表達,MMPs的過表達可進一步增加細胞外基質的降解[17]。這說明明膠的大量產生會加劇炎癥反應,而炎癥反應又可能促進膠原的降解,從而加重疾病。有文獻報道,促炎因子可增加白細胞的聚集[18]。本研究發現NF-κB抑制劑PDTC能夠抑制RAW264.7細胞的聚集(圖5)。此外,有研究發現吞噬細胞黏附到細胞外基質衍生片段能夠增強其吞噬功能,如纖維連接蛋白[19]。我們猜想明膠促進RAW264.7細胞形成多細胞聚集體的同時是否會增強巨噬細胞的吞噬功能？因此,后續研究可以進一步探究明膠對巨噬細胞炎癥反應以及吞噬功能的影響。

綜上所述,本研究顯示,明膠通過NF-κB信號通路促進RAW264.7細胞形成多細胞聚集體和釋放促炎性細胞因子。這為未來更好地研究細胞外基質在疾病發展過程中的作用提供了一定的數據支撐。