基于網絡藥理學的定眩湯治療頸性眩暈的作用機制研究

武越 銀河 陳琳 張威 周猷 魏戌 李晉玉 朱立國

摘要 目的：基于網絡藥理學探討中藥復方定眩湯治療頸性眩暈的分子機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫和BATMAN-TCM數據庫篩選藥物相關靶點，通過國際公認疾病基因數據庫篩選疾病相關靶點，取交集后獲得直接靶點并在STRING數據庫中進行擴充，后進行網絡拓撲分析獲得定眩湯治療頸性眩暈的關鍵靶點，進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，以進一步分析其治療頸性眩暈的分子機制。結果：在TSMSP數據庫與BATMAN-TCM數據庫中共提取出活性成分所對應的靶點350個。在疾病基因數據庫中得到與頸性眩暈相關的已知靶點253個。2組靶點映射后得到定眩湯作用于頸性眩暈的直接靶點21個，經STRING數據庫擴充后得到199個直接和間接靶點。在Cytoscape中進行網絡拓撲分析共篩選出99個關鍵節點，GO分析結果表明，關鍵節點的生物過程主要包括細胞增殖、細胞凋亡等;細胞成分主要包括核染色質、細胞外空間等;分子功能主要包括酶結合、DNA結合等。涉及的信號通路有MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路等。結論：定眩湯治療頸性眩暈具有多成分、多靶點的特點;研究初步探討了定眩湯作用的關鍵靶點及涉及的生物學過程和信號通路，發現其主要作用可能是影響骨平衡、調節骨代謝、促進血管的修復、調控相關炎癥反應。

關鍵詞 定眩湯;頸性眩暈;網絡藥理學;分子機制;信號通路;生物學過程;骨代謝;血管修復

Abstract Objective：To explore the possible molecular mechanism of Dingxuan Decoction in the treatment of cervical vertigo based on network pharmacology.Methods：Drug-related targets through the TCMSP database and BATMAN-TCM database were screened，disease-related targets through the internationally recognized disease gene database were screened，direct targets were obtained after the intersection and expanded them in the STRING database，and then network topology analysis was performed to obtain the key target of Dingxuan Decoction for the treatment of cervical vertigo.GO and KEGG function enrichment analysis were carried out to further analyze the molecular mechanism of the treatment of cervical vertigo.Results：A total of 350 targets corresponding to the active ingredients were extracted from the TSMSP database and the BATMAN-TCM database.In the disease gene database，253 known targets related to cervical vertigo were obtained.After the 2 sets of targets were mapped，21 direct targets of Dingxuan Decoction for cervical vertigo were obtained.After the STRING database was expanded，199 direct and indirect targets were obtained.A total of 99 key nodes were screened out by network topology analysis in Cytoscape，and GO analysis was performed.The results showed that the biological processes of key nodes mainly include cell proliferation，apoptosis，etc.cell components mainly include nuclear chromatin，extracellular space，etc.The molecular functions mainly include enzyme binding，DNA binding and so on.The signal pathways involved were：MAPK signal pathway，PI3K-Akt signal pathway，VEGF signal pathway，etc.Conclusion：The treatment of cervical vertigo with Dingxuan Decoction has the characteristics of multiple components and multiple targets.The key targets，biological processes and signaling pathways involved in the action of Dingxuan decoction are preliminarily investigated，and it is found that its main functions might be to affect bone balance，regulate bone metabolism，promote vascular repair and regulate the process of related inflammation.

Keywords Dingxuan Decoction; Cervical vertigo; Network pharmacology; Molecular mechanism; Signal pathway; Biological process; Bone metabolism; Vascular repair

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.001

頸性眩暈（Cervical Vertigo，CV）是指由于勞損、退變等諸多因素，機體出現頸椎椎體結構異常、交感神經興奮、椎動脈病變等病理變化，從而在頸椎活動過程中產生以眩暈為主的癥狀，大部分患者可伴有頭痛、惡心嘔吐，更有甚者出現短暫性發作性意識障礙或跌仆等癥狀的臨床綜合征[1-2]。據研究顯示，頸性眩暈在我國成人中發病率為17.3%[3]，隨著現代社會“低頭族”的增多，頸性眩暈的患者年齡逐漸年輕化。因其發病率較高，患者頭暈惡心明顯，影響生命質量。

臨床上常以半夏白術天麻湯治療CV[4-6]，中藥復方定眩湯（川芎、黃芩、延胡索、葛根、石菖蒲、天麻、白術、半夏、鉤藤、白芷）是中國中醫科學院首席研究員朱立國教授在半夏白術天麻湯基礎上根據經驗加減而成，此方治療頸性眩暈效果顯著，能有效改善患者眩暈癥狀，提高患者生命質量。但定眩湯成分較多，同時中藥又具有多成分、多靶點和系統調節的特點，基礎實驗研究很難展現中藥復方全面系統的作用。而網絡藥理學能夠運用現代網絡技術，從多角度、多靶點的層面上分析中藥復方可能的作用機制[7]。因此借助網絡藥理學的思路篩選定眩湯組成藥物的有效活性成分及靶點，分析其治療CV的關鍵靶點和信號通路具有重要意義，可為后續的進一步研究指明方向。

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件 在中藥成分檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫、BATMAN-TCM數據庫中查詢并篩選定眩湯的組成成分及相對應的靶點;在疾病數據庫（DRUGBANK數據庫、OMIM數據庫、GeneCards數據庫）中查詢并篩選與頸性眩暈有關的基因;在Uniport數據庫中對蛋白質進行標準化;在STRING數據庫中進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）分析;并運用Cytoscape 3.5.1軟件、ClueGO插件進行網絡圖的構建及數據分析[8]。以上數據庫的使用時間截至2019年12月，研究的思路流程見圖1。

1.2 定眩湯有效活性成分及靶點的查詢與篩選 將除天麻之外的9味中藥分別輸中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），將口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）設置為≥30%，類藥性（Drug Like，DL）指數設置為≥0.18，在中藥分子機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular MechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）中搜索天麻（Change Score cutoff to 20 and Adjusted P-value cutoff to 0.05），在Excel表格中記錄2個數據庫所得信息，并在Uniprot（http：//www.uniprot.org/）中的Uniprot KB數據庫以條件為Organism：Homo Sapiens（Human）檢索篩選所得靶點的對應基因，并結合相關文獻報道最終確定定眩湯的活性成分及靶點。

1.3 定眩湯“復方-藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建 將獲得的與定眩湯有關的活性成分及靶點導入軟件Cytoscape 3.2.1中構建“中藥-活性成分-靶點”網絡，后運用Cytoscape中的network analyzer功能對此網絡加以拓撲分析，以篩選出其中較為重要的靶點。

1.4 已知的CV相關疾病靶點檢索 采用“cervical vertigo”為關鍵詞，在國際公認的疾病相關數據庫中（其中包括DrugBank數據庫、OMIM數據庫、GeneCards等）來對CV發病相關靶點進行查詢篩選。將查詢結果中重復靶點去除，得到與CV發病過程相關的已知靶點。

1.5 定眩湯作用于CV的關鍵靶點探索 將定眩湯中篩選出的靶點與CV的相關靶點進行映射，將得到的直接靶點在STRING數據庫進行靶點的擴充，并刪除重復項，篩選后得到定眩湯作用于CV的直接和間接靶點。并將篩選后的靶點進行網絡拓撲分析，以明確與CV相關的靶點中較為關鍵的靶點，并繪制蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖。

1.6 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析 通過STRING數據庫對關鍵靶點的生物過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）進行分析，篩選出P<0.05的富集結果;同時運用Cytoscape 3.5.1軟件中的“ClueGO”功能對核心靶點進行KEGG富集分析，得到顯著富集的信號通路（P<0.01），并按通路的重要性來繪制餅狀圖;在分析得出的結果圖中，不同的節點表示不同的KEGG通路，相同類型的通路用用一種顏色表示，節點的大小則表示該信號通路的重要性的大小。

2 結果

2.1 定眩湯有效活性成分及靶點的查詢與篩選 在TCMSP數據庫中，按照OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件，經過查找篩選后，在該數據庫中找到上述9味中藥的有效活性成分共177個。其中半夏13個，白術7個，石菖蒲5個，川芎7個，黃芩36個，延胡索49個，白芷23個，葛根4個，鉤藤33個，在BATMAN-TCM數據庫中搜索天麻（條件為Change Score cutoff to 20 and Adjusted P-value cutoff to 0.05），共得到23個活性成分，將活性成分所對應的靶點提取，根據Uniprot ID刪除重復項，最終共得到定眩湯組成中藥的活性成分所對應的350個靶點。

2.2 定眩湯“復方-藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建 將與組成中藥有關的活性成分及對應的靶基因導入Cytoscape中，制作活性成分和作用靶基因的關系網絡圖，按DC值的不同對該網絡中節點進行分類，篩選出定眩湯中的關鍵作用靶點。如圖2所示，在此Cytoscape網絡圖中，共342個節點和3 828個聯系。

2.3 已知的CV相關疾病靶點檢索 選取國際公認的與疾病基因相關的數據庫，查找與CV關系密切的已知基因，通過疾病基因相關數據庫共搜索到263個疾病相關靶點（其中GeneCards 19個，OMIM 240個，DRUGBANK 4個），去重后得到個253個相關靶點。見圖3。

2.4 定眩湯作用于CV的關鍵靶點探索

2.4.1 定眩湯治療CV直接和間接靶點的探索 將定眩湯的350個靶點和CV的253個靶點進行映射，共得到21個直接靶點，將21個直接靶點在STRING數據庫中的Protein by Name欄目中輸入，對每個靶點進行擴充，探究與其相關的靶點，最終篩選高置信度（置信度>0.7）的PPI關系1 598個，去重之后獲得199個直接和間接靶點。見圖4。

2.4.2 定眩湯治療CV的PPI網絡構建 機體疾病的發生往往受到多通路的網絡相互影響，中藥的治療作用不僅僅是對靶點直接進行調控，還存在著間接調控的方式。因此我們可根據PPI關系數據對靶點間的直接和間接聯系進行研究。在STRING數據庫中以置信度>0.4為條件進行PPI網絡的構建，本研究發現定眩湯治療CV的直接與間接靶點之間的相互聯系有3 181種。見圖5。

2.4.3 定眩湯治療CV的關鍵靶點 本研究對定眩湯治療CV的PPI網絡進行拓撲分析，從而尋找出網絡中關鍵節點，并探究關鍵節點在網絡中重要的作用。通過網絡圖形化工具Cytoscape對上述網絡進行拓撲分析，篩選出其中DC值大于31的關鍵節點共98個，并在STRING數據庫中以置信度>0.4為條件完成相關網絡構建。見圖6。其中節點間聯系共1 878條。

2.5 定眩湯治療CV基因GO富集分析 在GO富集分析中，生物過程（BP）共1 805個GO條目，排名靠前的主要包括細胞對化學刺激的反應、對脂質反應、細胞增殖的調節、凋亡過程的調控、蛋白質代謝過程的正向調節等;細胞成分（CC）共個84個GO條目，排名靠前的主要包括核染色質、細胞外空間、細胞外區域、胞質部分、質膜部分;分子功能（MF）共168個GO條目，排名靠前的主要包括蛋白結合、RNA聚合酶Ⅱ特異的DNA結合、腺苷酸環化酶活性、鳥苷酸環化酶活性、生長因子受體結合、細胞因子活性等。

2.6 定眩湯治療CV基因KEGG富集分析 運用Cytoscape 3.5.1軟件中的“ClueGO”功能進行信號通路分析，在P小于0.01的條件下，確定了127條相關信號通路，通路之間的關系達到1 459種。其中信號通路主要涉及炎癥反應、成骨和破骨細胞分化、血管內皮細胞的修復、激素代謝、脂肪細胞的調節、衰老等方面，富集明顯的通路主要是癌癥相關的通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、松弛素信號通路、趨化因子信號通路、FoxO信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路等。見圖7。

3 討論

頸性眩暈又被稱為椎動脈型頸椎病眩暈，臨床上表現為眩暈、惡心等癥狀，老年患者居多，椎動脈缺血、血管管腔狹窄、動脈粥樣硬化等均可導致眩暈的發生[9]。隨著現代社會節奏的加快、社會壓力的增大、人口老齡化程度的增加，CV發病率逐年遞增，且年輕化趨勢明顯。該病發病機制尚不明確，現代醫學認為，CV主要是因為頸椎間盤突出、骨質增生等壓迫椎動脈、局部炎癥介質的刺激頸交感神經，進而誘發椎動脈痙攣，導致后循環供血不足，出現眩暈、頭痛、惡心等癥狀[10]。在治療上除運用手術外，可采用針灸、推拿等理療手段配合服用血管擴張劑、非甾體抗炎藥、中藥等藥物治療，也取得了良好的臨床效果[11]。頸性眩暈在中醫學中屬于“眩暈”病癥。《丹溪心法》中有“無痰則不作眩”的描述;《丹溪心法·頭眩》中提到“頭眩，痰挾氣虛并火”。可得出痰火相結也會導致眩暈的發生。本病在早期及發作期時，癥狀多表現為實癥，病因病機以風、火、痰、瘀為主;臨床分型有風陽上擾型、痰濁內阻型、瘀血內停型等。本研究所用的定眩湯以君藥天麻定弦熄風，石菖蒲化痰開竅，以臣藥半夏燥濕化痰止嘔，白術健脾補氣，兩藥相輔，增強化痰之功;佐延胡索、川芎活血止痛，葛根解肌通陽，黃芩清熱燥濕，鉤藤清熱熄風。諸藥合用，使濕除痰化，氣行血活，受蒙之清竅得以升通，眩暈得安。且課題組前期通過小樣本隨機對照試驗證實，中藥口服治療頸性眩暈較對照組甲磺酸倍他司汀片療效顯著，能夠明顯改良患者眩暈癥狀，提高患者生命質量。

本研究通過對PPI分析結果發現，AKT1、TNF、TP53、CXCL8、VEGFA等是中藥治療的核心靶點，AKT1是AKT家族的一員，可調控細胞增殖和生長，與細胞凋亡和能量代謝等細胞過程相關。TP53基因編碼的P53蛋白的重要作用是調控細胞分裂和增殖，AKT1與TP53在CV發生發展過程中影響成骨與破骨細胞的增殖與抑制，調控骨質的生長。CXCL8是一個多種細胞來源的趨化因子，可趨化中性粒細胞，對炎癥反應進行調節，影響骨與關節退行性疾病的發生發展，同時又參與調控細胞的生長、分化等。TNF為腫瘤壞死因子，分為TNF-α，TNF-β 2種，TNF-α是一種由激活的巨噬細胞產生的能抑制成骨細胞和刺激破骨細胞的細胞因子，研究表明，目前大量TNF-α阻斷劑具有減輕炎癥反應并改善手術預后的作用，能夠使椎間盤退變的進程減慢[12]。因此，在炎癥反應中，TNF和CXCL8可能與頸椎間盤退行性病變的發生發展緊密相關，可以減緩由于椎間盤的突出導致的局部炎癥反應進程。VEGFA為血管內皮生長因子A，是VEGF家族的一員[13]，VEGFA和VEGFB主要促進新血管的形成，在血管生成、腫瘤生長以及缺血性疾病中起著重要作用[14]，可修復已損傷的椎動脈，恢復腦供血，減輕CV的臨床表現。

從GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果來看，定眩湯的作用主要是影響骨平衡、調節骨代謝、促進血管的修復、調控炎癥的進程。KEGG富集結果顯著的通路是MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、松弛素信號通路、趨化因子信號通路、FoxO信號通路、VEGFA信號通路等，MAPK信號通路調控細胞的增殖、分化，對機體的骨代謝平衡的維持起著重要作用[15]。PI3K能夠激活Akt，增加Ras同源基因家族中A的表達量，起到改變細胞骨架的作用[16]。松弛素有保護心血管的作用，可以降低外周循環的血管壓力，有研究表明動脈的機械特性和心輸出量可通過長時間應用松弛素進行改善[17]。有研究表明FOXOs可提高細胞的抗氧化能力，減緩與年齡密切相關疾病的發展，如癌癥、心血管疾病、骨質疏松等[18-20]。在炎癥反應組織可找到廣泛的趨化因子，趨化因子可以驅使炎癥細胞向炎癥組織靠近，并參與免疫應答，有研究表明，在骨性關節炎的發生發展過程中趨化因子起了重要作用[21-23]。血管內皮生長因子（VEGF）被認為是血管生成的中樞調節劑[24]，其本質是肝素結合性雙價蛋白，是一種與血管生長相關的特異性生長因子，正常生理條件下由中性粒細胞及血小板分泌，在缺氧的環境中則由角質形成細胞和上皮細胞產生[25]，VEGF在維持和恢復血管內皮細胞的完整性中發揮重要作用，同時也可增加側支循環的血量，起到保護腦供血作用。

綜上所述，中藥復方定眩湯治療CV的可能機制有：1）調控頸椎的骨代謝，恢復成骨細胞與破骨細胞的平衡，減輕頸椎骨質的退變;2）在頸椎間盤退變的過程中，常伴有炎癥反應，定眩湯能夠控制炎癥的發展，減輕局部炎癥介質的不良刺激，從而減輕椎動脈的痙攣和交感神經的興奮，改善眩暈的癥狀;3）同時定眩湯能夠增加心輸出量，減小周圍血管的阻力，增加側支循環的血量，使椎基底動脈的供血量增大，眩暈的程度減輕;4）定眩湯能夠促進血管新生，使由于受到頸椎異常結構的不良影響而受損椎動脈內皮細胞得到修復，恢復局部的正常供血，增加大腦后循環的血量。通過網絡藥理學中所涉及的現代網絡技術手段可以分析藥物與疾病靶點的相互網絡關系，從而可以推測定眩湯治療CV的作用機制，為后續的進一步的研究指明了方向，使實驗研究更加明確、更加具有目的性，同時篩選出了關鍵的作用靶點及信號通路，為今后進一步從分子生物學角度進行驗證奠定了基礎。

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（2020-05-18收稿 責任編輯：楊覺雄）