骨痹湯對膝骨關節炎大鼠軟骨中基質金屬蛋白酶-13及轉化生長因子-β₁的影響

李陽 張麗曼 張立穎 狄生云 王菲 姜雪原

摘要 目的：探討骨痹湯對膝骨關節炎大鼠軟骨基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）及轉化生長因子-β1（TGF-β1）的影響。方法：選擇健康SD大鼠40只，建立膝骨關節炎模型，隨機分為對照組和觀察組，每組20只。對照組造模術后不予治療，觀察組自造模成功后，給予骨痹湯熏蒸治療，療程4個周。治療后，比較每組大鼠痛閾、膝關節周徑及膝關節活動度情況。采用免疫組織化學法檢測各組大鼠關節軟骨中MMP-13及TGF-β1表達變化情況。結果：治療后，觀察組痛閾、膝關節周徑及膝關節活動范圍比對照組明顯改善（P<0.05）;治療后，觀察組MMP-13表達水平明顯下降，且明顯低于對照組（P<0.05）;治療后，觀察組TGF-β1表達水平明顯升高，且明顯高于對照組（P<0.05）。結論：骨痹湯可改善膝骨關節炎的疼痛，減少軟骨中MMP-13的表達，延緩骨性關節炎的發展，并明顯上調TGF-β1的表達，促進軟骨修復。

關鍵詞 骨痹湯;熏蒸治療;骨關節炎;膝關節;基質金屬蛋白酶-13;轉化生長因子-β1;疾病模型;動物

Abstract Objective：To investigate the effect of Gubi Decoction on matrix metalloproteinase-13 and transforming growth factor β1 in knee osteoarthritis rats.Methods：A total of 40 healthy SD rats were selected to establish knee osteoarthritis model，and randomly divided into a control group and a treatment group，with 20 rats in each group.The control group was not treated after the model making operation，and the treatment group was given fumigating and steaming treatment of Gubi Decoction for 4 weeks.After treatment，the pain threshold，the diameter of the knee joint and the activity of the knee joint were compared.The expression of matrix metalloproteinase-13（MMP-13）and transforming growth factor β1（TGF-β1）in articular cartilage of rats in each group was detected by immunohistochemistry.Results：After treatment，the pain threshold，the diameter of knee joint and the range of motion of knee joint in the treatment group were significantly improved，compared with the control group（P<0.05）; the expression level of MMP-13 in the treatment group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）; the expression level of TGF-β1 in the treatment group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）.Conclusion：Gubi Decoction can improve the pain of knee osteoarthritis，reduce the expression of MMP-13 in cartilage，delay the development of osteoarthritis，and obviously up regulate the expression of TGF-β1 to promote cartilage repair.

Keywords Gubi Decoction; Fumigation treatment; Osteoarthritis; Knee joint; Matrix metalloproteinase-13; Transforming growth factor beta 1; Disease model; Animal model

中圖分類號：R289.5;R684文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.006

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是臨床常見的關節疾病，中老年人是高發人群，其中以膝骨關節炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是最為常見[1]。隨著我國人口老齡化的不斷加劇，KOA的發病率不斷增高，其具有極高的致殘率，給患者的生命質量帶來嚴重影響[2]。KOA的病理基礎是關節軟骨呈現退行性的病變，臨床癥狀主要表現為膝關節活動受限、疼痛、行走困難，膝關節畸形等[3-4]。早中期KOA可采取非手術治療，晚期則需要進行手術治療[5]。早中期若能有效藥物治療，可促進膝關節組織軟骨的修復，有效延遲病變進程。西醫通常采用口服塞來昔布、布洛芬等非甾體抗炎藥物及關節腔注射玻璃酸鈉的方式來緩解膝關節疼痛，潤滑關節，達到治療的目的，但長期用藥會增加各種不良反應[6]。中醫對KOA的治療方式較多，包括中藥內服外用、針灸、推拿、小針刀及中藥熏蒸等，均具有一定的療效[7]。骨痹湯具有補益肝腎及化痰祛瘀的作用，通過熏蒸的方式使藥物滲透進膝關節周圍，從而更好發揮其作用，達到舒筋通絡、活血止痛的作用，并無不良反應[8]。本研究通過對KOA大鼠給予骨痹湯熏蒸治療，探討其對軟骨基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）及轉化生長因子-β1（TGF-β1）的影響，闡述其治療KOA的可能作用機制，以期為KOA的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用健康SD大鼠（動物批準號：SCXK（京）2018-0021）40只，體質量16～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，飼養于清潔級實驗室中（室溫20～24 ℃，濕度40%～60%）觀察3 d后，用于實驗。

1.1.2 藥物 骨痹湯制作：乳香10 g、沒藥10 g、艾葉20 g、海桐皮20 g、透骨草30 g、蘇木20 g、紅花15 g、防風10 g、伸筋草30 g、木瓜15 g、淫羊藿15 g、羌活10 g、獨活10 g、川牛膝15 g、澤蘭15 g、桂枝20 g。自動煎藥機煎煮成70%濃度的中藥液保存。

1.1.3 試劑與儀器 二甲苯（批號：190712）、枸櫞酸鹽（批號：191104）、PBS（批號：190805）、過氧化氫溶液（批號：190415）、DBA試劑盒（批號：190904）、大鼠抗MMP-13（批號：190813）、TGF-β1（批號：191005）以上均由北京歐北生物科技有限公司提供。切片機（Leica，德國，型號：RM2245，），顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：Olympus IX71），恒溫箱（上海醫療器械廠有限公司，型號：ZLHS-80-LS），甩尾測痛儀（成都泰盟軟件有限公司，型號：SW-200），自制動物熏蒸裝置。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SD大鼠隨機分對照組和觀察組，每組20只，適應性飼養1周后，采用單側跟腱切除法，建立KOA模型。

1.2.2 干預方法 2組大鼠術后均常規飼養，自由活動，對照組不采取任何干預措施，觀察組建模成功后第2天，給予骨痹湯熏蒸治療：將大鼠放入自制動物熏蒸裝置進行全身熏蒸，蒸汽溫度為40 ℃，1次/d，20 min/次，連續治療4周。

1.2.3 檢測指標與方法 在造模前及治療4周后，采用熱輻射甩尾測痛儀對2組大鼠的痛閾進行測量。造模前及治療4周后，將2組大鼠膝關節伸展，回縮膝關節，采用量角器測量其伸展至回縮的角度。造模前及治療4周后，采用無彈性的軟皮尺測量大鼠膝關節的周徑。

治療4周后，處死各組大鼠后，取其后肢膝關節股骨端軟骨作為標本，放入10%中性甲醛溶液固定，15%EDTA溶液中脫鈣、脫水、透明，石蠟包埋后連續切片（厚度：5 μm），采用免疫組織化學染色檢測MMP-13及TGF-β1表達情況：將切片并放入60 ℃恒溫箱烤片過夜，二甲苯脫蠟，依次放入95%、85%、80%及75%的乙醇中各10 min，蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL，20 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次，加入50 μL的一抗，4 ℃下過夜后，加入二抗，20 ℃孵育10 min，DBA試劑盒顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用蒸餾水洗掉，終止顯色，采取蘇木精復染2 min，中性樹膠封片。并以細胞呈棕黃色染色判斷為陽性。每張切片隨機抽取4個400×高倍鏡視野，計算出陽性細胞所占百分比，并進行百分比評分（PP），標準為[9]：1）0分：無陽性細胞;2）1分：陽性細胞百分比<5%;3）2分：5%<陽性細胞百分比≤20%;4）3分：陽性細胞百分比>20%;對染色強度進行評分（SI）：1）0分：無染色;2）1分：淡黃色;3）2分：棕黃色;4）3分：棕褐色。免疫反應評分（IRS）=PP×SI。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠的痛閾、膝關節周徑及膝關節活動度情況

治療后，觀察組痛閾、膝關節周徑及膝關節活動范圍比對照組明顯改善，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 2組大鼠軟骨組織MMP-13及TGF-β1表達情況

治療后，觀察組MMP-13表達水平明顯下降，且明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），觀察組TGF-β1表達水平明顯升高，且明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖1～2。

3 討論

KOA是臨床最常見的關節性疾病，其病理特點主要表現為軟骨下骨硬化、肌肉萎縮無力、滑膜增生、關節囊攣縮、關節軟骨不同程度的破壞等[10]。KOA的發病機制主要有自身免疫反應學說、軟骨細胞凋亡學說、軟骨酶降解學說和軟骨機制內的穩態失衡學說等[11]。中醫學認為KOA屬于“膝痹”“骨痹”“筋痹”等范疇，認為外邪（風、寒、濕等）入侵肌腠、經絡及筋骨關節，導致關節損傷，從而引發KOA，多數KOA屬于痰濕內阻、肝腎虧虛、氣虛血瘀等，多屬本虛標實，因此臨床治療多以祛濕化痰，祛瘀化痰及補益肝腎為宗旨[12]。

中藥熏蒸是中醫的一種治療方法，具有悠久的歷史，其操作簡單，適用較廣，并有明顯的療效[13]。本研究中的骨痹湯藥方中的伸筋草、透骨草、蘇木及海桐皮具有舒筋活絡，祛風濕的功效;乳香、紅花及沒藥具有止痹痛，理氣活血的效果;艾葉具有通痹舒筋，溫經散寒的功效;羌活、防風及獨活可起到勝濕止痛，祛風解表的功效;淫羊藿具有止痹痛，補肝腎之功效;木瓜可起到緩解筋脈拘攣、風濕痹痛的作用;川牛膝可強筋骨，益肝腎，活血化瘀，通利血脈，利關節，桂枝具有溫通經脈，發汗解肌的功效;諸藥共用，可起到祛痰濕、補肝腎、通經脈、緩拘攣及止痹痛之效[14-15]。KOA大鼠經過骨痹湯熏蒸治療后，其痛閾、膝關節周徑及膝關節活動范圍均明顯改善，這可使藥效經過熱力，快速滲入皮膚，作用于肌體，從而使關節腔內的積液得到消除，減少關節腫脹程度，擴大膝關節活動范圍;局部高溫可使膝關節部位氣血更加流暢，加快血液循環，緩解關節疼痛，達到“通則不痛”的效果。

KOA的發生與多種信號通路有密切關系，相關研究證實，金屬蛋白類可抑制軟骨組織細胞外基質形成的主要通路，在KOA的發生及發展過程中起到重要作用[16]。MMP-13可參與組織愈合、形態生成及損傷修復等多種正常生理病理過程，其在心血管疾病、癌癥及KOA等病變過程中起到促進作用[17]。骨痹湯熏蒸治療后，KOA大鼠的MMP-13水平明顯下降，且比其他大鼠明顯，這與相關研究結果相一致[18]，這可能是因為通過骨痹湯熏蒸治療后，通過熱力和藥力共同作用下，膝骨關節軟骨組織中的MMP-13表達水平下調，使異常激活的細胞外基質蛋白質降解等生物學功能得到有效改善，從而促進病情迅速恢復。

TGF-β1是一種轉化生長因子，在軟骨細胞的生長、增殖及分化過程中發揮重要作用，對細胞外基質形成、軟骨修復重建起到重要的調節作用[19-20]。骨痹湯熏蒸治療后，KOA大鼠TGF-β1表達水平明顯升高，這是因為熏蒸治療可通過局部良性刺激，可有效調節機體的免疫功能，進而刺激TGF-β1的大量合成與分泌，使其在軟骨組織中廣泛表達，促進軟骨修復。

綜上所述，骨痹湯熏蒸治療，可對KOA大鼠起到活血止痛，過下調MMP-13表達，提高TGF-β1表達水平，促進關節軟骨修復，發揮中醫藥的優勢，對KOA具有一定預防和治療作用。

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（2020-04-08收稿 責任編輯：楊覺雄）