異功散對哮喘小鼠氣道炎癥反應和腸道菌群的影響

梁燕妮 歐陽學認 廖永州

摘要 目的：研究異功散對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥反應的抑制及其對腸道菌群結構的調節作用。方法：將無特定病原體（SPF）級雄性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、異功散組和西藥組，每組10只。通過抗生素誘導、致敏和霧化激發建立腸道菌群紊亂的哮喘小鼠模型。觀察小鼠一般情況、肺組織病理變化，對各組小鼠糞便進行16S rRNA測序并分析治療前后腸道菌群的變化。結果：1）異功散組和西藥組的哮喘小鼠的生理狀態、哮喘癥狀較模型組明顯好轉;2）與模型組比較，異功散組和西藥組小鼠肺組織炎癥反應得到明顯改善;3）與空白對照組比較，模型組的Chao1指數顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，異功散組和西藥組的Chao1指數明顯回升（P<0.05）。與模型組比較，異功散組的擬普雷沃菌屬和普雷沃菌屬的比例明顯回升，而乳桿菌屬和擬桿菌屬的比例下降。結論：異功散改善哮喘小鼠的癥狀和氣道炎癥反應的作用可能與其恢復腸道菌群的豐富度和多樣性以及調節菌群結構的平衡有關。

關鍵詞 異功散;哮喘;脾胃虛弱;氣道;炎癥反應;腸道菌群;16S rRNA測序

Abstract Objective：To study the inhibitory effect of Yi Gong Powder on airway inflammation in bronchial asthma mice and its regulation on the structure of intestinal flora.Methods：SPF grade male mice were randomly divided into a blank control group，a model group，a Yi Gong Powder group and a Western medicine group，with 10 in each group.A mouse model of asthma with intestinal flora disorder was established through antibiotic induction，sensitization and nebulization.The general condition of mice and the pathological changes of lung tissues were observed.The feces of each group of mice were sequenced by 16S rRNA and the changes of intestinal flora before and after treatment were analyzed.Results：1）The physiological status and asthma symptoms of asthma mice in Yi Gong Powder group（Y）and Western medicine group were better than those in model group.2）Compared with the model group，the lung tissue inflammation of the Yi Gong Powder group and the Western medicine group was significantly improved.3）16S rRNA sequencing results showed that：compared with the blank control group，the Chao1 index of the model group was significantly reduced（P<0.01）; compared with the model group，the Chao1 index of the Yi Gong Powder group increased significantly（P<0.05）.At the genus level of the bacterial group structure，compared with the model group（M），the proportion of Alloprevotella and Prevotella in the Yi Gong Powder group increased significantly，but there was a certain gap from blank control group，while the proportion of Lactobacillus and Bacteroides has declined.Conclusion：The effects of Yi Gong Powder on improving the symptoms and airway inflammation in asthmatic mice may be related to restoring the richness and diversity of intestinal flora and regulating the balance of flora structure.

Keywords Yi Gong Powder; Asthmatic; Spleen and stomach weakness; Airway; Inflammatory reaction; Intestinal flora; 16S rRNA sequencing

中圖分類號：R256.12;R562.2+5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.007

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥反應和氣道高反應性為特征的異質性疾病[1]。近20年來我國兒童哮喘的患病率呈顯著上升趨勢，且總體上以學齡前兒童最高[2]。哮喘對兒童的生活、學習甚至生命帶來嚴重的危害，如何更有效的防治哮喘一直是亟待解決的問題。有證據表明，微生物群在宿主的腸黏膜和免疫系統的發育中發揮著不可或缺的作用[3]，而大量服用抗生素的嬰幼兒在菌群結構遭到破壞的同時也增加了患哮喘疾病的風險[4]。近年來，腸道菌群與哮喘等過敏性疾病的關系成為研究熱點。

從中醫“整體觀念”的角度出發，腸道微生態的組成、結構多樣性和菌群代謝狀態的平衡與穩定是維持“脾主運化”正常功能狀態的重要因素[5-6]。在某種情況下這種平衡和穩定一旦被破壞，就會出現脾胃功能的失調，如脾胃虛弱導致“脾主運化”功能減弱，津液疏布失常而釀生痰濁。中醫認為哮病以宿痰伏于肺為主因，而脾胃虛弱則是貫穿哮喘病發作期與緩解期總病程的核心病機[7]，故中醫對哮喘的治療應注意培補中焦，而異功散是健脾益氣的代表方劑之一。本實驗擬探討異功散對哮喘小鼠氣道炎癥反應的抑制及腸道菌群的調節作用，為中醫藥防治哮喘提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取無特定病原體（SPF）級健康雄性BALB/C小鼠40只，3周齡，體質量（13±3）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。本實驗對動物的處理符合動物倫理學要求（倫理審批號：20190611028）。喂養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心，溫度為22～23 ℃，濕度為60%～70%，每天光照與黑夜各12 h交替。

1.1.2 藥物 異功散按《小兒藥證直訣》所載原方比例：人參、茯苓、白術、陳皮、甘草各10 g。中藥均由廣州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，制成水煎劑，并配成含生藥約1 g/mL的溶液，充分攪勻，貯于4 ℃冰箱備用[8]。卵清蛋白（OVA）（上海麥克林生化科技有限公司，生產批號：A800616），Al（OH）3（上海麥克林生化科技有限公司，生產批號：A800852），常樂康膠囊（酪酸梭菌二聯活菌散）（山東科興生物制品有限公司，國藥準字S20020015），頭孢哌酮坦鹽鈉（上海麥克林生化科技有限公司，國藥準字S838445）。

1.1.3 試劑與儀器 電子天平稱（杭州萬特衡器有限公司，型號：WT型）;冰凍切片機（Thermo Scientific公司，美國，型號：CryoStar NX50）;生物顯微鏡（Nikon公司，日本，型號：55i）;彩色圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國，型號：Image-Pro Plus7）;超低溫冰箱（海爾公司，型號：DW-86L626）;小動物超聲霧化器[歐姆龍自動化（中國）有限公司，型號：NE-C28P]。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用簡單隨機分配法，將小鼠分為空白對照組、模型組、異功散組和西藥組，每組10只。哮喘小鼠模型的建立[9]：適應性喂養3 d結束后（第0天），給予BALB/C小鼠0.5 g/L的頭孢哌酮水溶液，自由飲用，連續5 d。第6天將頭孢哌酮水換成無菌水。分別于第0天和第7天在小鼠雙側胸部、腹股溝4部位各皮下注射0.15 mL配置好的卵清蛋白（OVA）凝膠致敏劑（將OVA 1 mg和氫氧化鋁200 mg溶于生理鹽水1 mL中配制而成），同時腹腔注射0.4 mL，共計1 mL進行致敏。第14天開始將小鼠置于25 cm×20 cm×20 cm有機玻璃盒內，超聲霧化吸入1%OVA誘發哮喘，1次/d，30 min/次，連續5 d。當小鼠出現嗆咳、呼吸困難、躁動不安、活動量下降等癥狀時表示哮喘激發成功。

1.2.2 給藥方法 第20天開始給藥干預，異功散組以每次10 mL/kg的給藥量經口灌服;西藥組灌服常樂康0.4 mL[10]，同時給予布地奈德2 mL+生理鹽水2 mL霧化15 min;模型組及空白對照組均灌服生理鹽水。以上各組給藥均為1次/d，連續1周，療程結束24 h后處死小鼠取材。

1.2.3 標本采集 采用頸椎脫臼法處死小鼠，沿正中線由下而上剪開胸腔，逐層游離、暴露肺組織。摘取左肺組織，將其放入4%多聚甲醛溶液。同時每組隨機挑選5只小鼠的結腸糞便，收集至無菌EP管，并于液氮中保存。

1.2.4 指標檢測與方法 1）觀察各組小鼠的精神狀態、納食、大小便、呼吸、毛發形體、姿態、活動及體質量等一般情況。2）肺和支氣管組織形態學變化：左肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，進行蘇木精-伊紅染色（HE染色），鏡下觀察各組小鼠支氣管形態和平滑肌損傷情況，炎性細胞浸潤情況以及管腔內是否有滲出物等。3）16S rRNA測序：小鼠糞便樣本由上海銳翌生物科技有限公司進行腸道菌群檢測。提取20個糞便樣本的DNA，并進行質檢。16S rRNA擴增選擇區域為V3-V4區，使用的通用引物為341F和806R。在通用引物的5′端加上適合Illumina Miseq PE250測序的index序列和接頭序列，完成特異性引物的設計。forward primer（5′-3′）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）reverse primer（5′-3′）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。對樣本中的DNA進行PCR擴增和產物純化、PCR產物定量和均一化，最后使用Illumina Miseq PE250進行上機測序。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差（±s）表示，數據符合正態分布且方差齊時采用單因素方差分析，否則用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量變化及一般狀況

造模前，各組小鼠反應正常。除空白對照組外，其余組小鼠在造模過程中，給予OVA霧化激發后小鼠出現呼吸急促，躁動不安，弓背，蜷縮，搔抓面部，納食、活動減少，毛發無光澤及體質量下降等情況。與模型組比較，給予異功散和西藥干預后，小鼠精神較前好轉，毛發相對更有光澤，納食、活動增多，體質量也明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 肺部病理學指標

空白對照組小鼠的肺組織支氣管、肺泡結構清晰，未見炎癥反應細胞;模型組小鼠支氣管周圍灶狀慢性炎癥細胞浸潤、支氣管上皮細胞鱗狀化生，偶見上皮細胞脫落，肺泡間隔中度增厚，增厚程度為正常厚度的3～5倍;異功散組和西藥組支氣管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤，支氣管上皮細胞未見鱗狀化生及脫落，大部分區域肺泡間隔未見增厚，局部肺泡間隔輕度增厚，肺泡腔內未見巨噬細胞。見圖1。

2.3 異功散對小鼠腸道菌群結構的影響

2.3.1 物種Alpha多樣性指數分析 本實驗收集了空白對照組、模型組、異功散組和西藥組各5只小鼠的糞便標本。根據16S rRNA測序結果繪制稀釋曲線如圖2，曲線趨向于平坦，表明測序量基本覆蓋樣品中所有物種，測序深度達到要求，可滿足分析需求。根據小鼠腸道菌群的Chao1豐富度指數和Shannon多樣性指數繪制圖3A、3B。圖中顯示：1）與空白對照組比較，模型組的Chao1指數顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）;給予異功散和西藥干預之后Chao1指數明顯回升，且異功散組與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。2）與空白對照組比較，模型組的Shannon指數有所下降，給予異功散和西藥干預后Shannon指數有一定程度的上升，但4組的差異無統計學意義。

2.3.2 物種Beta多樣性指數分析 各組小鼠腸道菌群的差異可通過繪制PCoA主成分分析圖（圖4）表示，其中相同顏色的點的距離越近說明其菌群的構成越相似。空白對照組、模型組與異功散組的樣品距離遠，各組的菌群構成存在明顯差異;而西藥組與空白對照組和模型組的距離較近，其群落差異較小。

2.3.3 物種菌群結構分析 從圖5中可發現，與空白對照組比較，模型組的擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）的比例顯著降低，普雷沃菌屬（Prevotella）的比例也有所下降，而乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的比例明顯上升。與模型組比較，給予藥物干預后，異功散組的擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）和普雷沃菌屬（Prevotella）的比例明顯回升，但與正常組有一定差距，而乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的比例下降;西藥組的乳桿菌屬（Lactobacillus）和嗜黏蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）的比例明顯增加。

3 討論

目前，兒童支氣管哮喘的研究取得了一定的進展，雖然其發病機制尚未完全清楚，但可以肯定的是哮喘的發生發展與免疫有關。Russell等[11]發現圍產期及新生小鼠經抗生素處理后其過敏性哮喘的檢測指標增加的同時，腸道細菌菌群的組成也發生了顯著變化，說明小鼠發生哮喘的危險性增加可能與抗生素的使用改變了其腸道菌群結構有關。這與Ahmadizar等[12]的研究結果相似，即生命早期接觸抗生素會增加成長后期出現過敏性哮喘的風險。而有研究證實，腸道黏膜遠端部位的微生物群可以調節宿主的全身性免疫反應，從而有助于減少致敏和過敏性炎癥反應[13-14]。

本實驗在造模前期選用抗生素頭孢哌酮誘導小鼠腸道菌群紊亂，并通過卵清蛋白（OVA）致敏、霧化激發，使小鼠出現呼吸急促，躁動不安，弓背，蜷縮，納食、活動減少等哮喘發作癥狀，根據模型組小鼠的肺組織病理和腸道菌群與空白對照組的差異有統計學意義，判定腸道菌群紊亂的哮喘小鼠模型成功建立。給予藥物干預后，與模型組比較，異功散組和西藥組小鼠的哮喘癥狀明顯緩解，體質量明顯增加（P<0.05），并且肺組織炎癥反應得到明顯改善，表明異功散在哮喘的治療中有較好的療效，這與既往的研究結果相一致[8]。

腸道微生態的結構變化不僅可以反映機體健康狀況，而且與哮喘等過敏性疾病的發生發展有一定的關系。李春燕等[15]以哮喘急性發作期患者開展病例對照研究，結果提示，哮喘患者的腸道菌群發生了明顯改變，表現為多樣性明顯降低，結構改變、失衡。在本實驗中，與空白對照組比較，模型組小鼠腸道菌群的Chao1豐富度指數顯著降低，Shannon多樣性指數也有所下降，并且在Beta多樣性分析中，其與空白對照組差異有統計學意義。說明哮喘模型小鼠的腸道菌群的確發生了改變，表現在豐富度和多樣性的降低，國外學者Arrieta等[16]的研究同樣也表明了哮喘小鼠腸道菌群的這種變化。藥物干預后，與模型組比較，異功散組的Chao1豐富度指數明顯升高，并且與空白對照組比較，差異無統計學意義，Shannon多樣性指數也有所上升。表明異功散可以使哮喘小鼠腸道菌群的豐富度恢復到正常水平，并在一定程度上增加其多樣性。

在菌群結構分析中，本實驗發現，與空白對照組比較，模型組小鼠的腸道菌群在菌屬水平上，表現為乳桿菌屬和擬桿菌屬的比例明顯升高，普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬的比例下降。國外研究者Ling等[17]、Chen等[18]同樣也發現過敏患兒的腸道菌群中乳桿菌屬、擬桿菌屬明顯增加，而普雷沃菌屬明顯減少，這與本實驗結果相一致。實驗中，給予藥物干預后，比較于模型組，異功散組的乳桿菌屬和擬桿菌屬比例明顯下降，而普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬的比例則增加，且優勢菌屬所占的比例更接近于正常組。這與王鐵柱[19]、鄉世健等[20]對哮喘模型動物給予藥物干預后菌屬的變化結果相吻合。

中醫認為，脾虛是哮喘發病的關鍵[21-22]。熊英等[23]發現脾虛所致的腸道菌群紊亂可能是加重兒童哮喘和導致哮喘慢性炎癥反應狀態的重要病機之一，所以對哮喘的治療離不開健脾補中之法，而異功散則是此法的代表方劑之一。研究證實，健脾中藥復方有助于調節腸道菌群，維持腸道微生態的平衡[24]。本實驗研究結果顯示哮喘小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性及菌群結構的確發生了改變，而這種改變在異功散的干預下得到了一定程度上的恢復，表明異功散可能通過恢復哮喘小鼠腸道菌群的平衡，從而實現改善哮喘癥狀和氣道炎癥反應的作用。本實驗為中醫藥從腸道微生態角度防治哮喘提供了新的思路，其具體作用機制有待于進一步研究。

參考文獻

[1]中華醫學會兒科學分會呼吸學組，《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）[J].中華兒科雜志，2016，54（3）：167-181.

[2]劉傳合，洪建國，尚云曉，等.中國16城市兒童哮喘患病率20年對比研究[J].中國實用兒科雜志，2015，30（8）：596-600.

[3]Macpherson AJ，Harris NL.Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system[J].Nat Rev Immunol，2004，4（6）：478-485.

[4]Couzin-Frankel J.Bacteria and asthma：untangling the links[J].Science，2010，330（6008）：1168-1169.

[5]邵鐵娟，李海昌，謝志軍，等.基于脾主運化理論探討脾虛濕困與腸道菌群紊亂的關系[J].中華中醫藥雜志，2014，29（12）：3762-3765.

[6]張玉佩，楊欽河，鄧遠軍，等.中焦濕熱證與胃腸道微生態關系芻議[J].中醫雜志，2016，57（24）：2094-2096.

[7]劉自力，張慶榮，吳兆利.論脾虛為哮喘宿根[J].中醫藥學刊，2006，24（2）294-295.

[8]劉華，歐陽學認，張雪麗，等.異功散早期干預對支氣管哮喘幼年小鼠氣道炎癥的影響[J].環球中醫藥，2017，10（10）：1167-1169.

[9]張睦涵，朱振剛.哮喘動物模型建立的研究進展[J].實驗動物科學，2018，35（4）：83-86.

[10]劉晨菁.嬰瀉顆粒治療抗生素相關性腹瀉的臨床和實驗研究[D].鄭州：河南中醫學院，2015.

[11]Russell SL，Gold MJ，Hartmann M，et al.Early life antibiotic-driven changes in microbiota enhance susceptibility to allergic asthma[J].EMBO Rep，2012，13（5）：440-447.

[12]Ahmadizar F，Vijverberg S，Arets H，et al.Early-life antibiotic exposure increases the risk of developing allergic symptoms later in life：A meta-analysis[J].Allergy，2018，73（5）：971-986.

[13]Hooper LV，Littman DR，Macpherson AJ.Interactions between the microbiota and the immune system[J].Science 2012，336（6086）：1268-1273.

[14]Mennini M，Dahdah L，Artesani MC，et al.Probiotics in Asthma and Allergy Prevention[J].Front Pediatr，2017，5：165.

[15]李春燕，李俊紅，張海員，等.支氣管哮喘患者腸道菌群多樣性變化[J].科技導報，2012，30（30）：63-67.

[16]Arrieta MC，Stiemsma LT，Dimitriu PA，et al.Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma[J].Sci Transl Med，2015，7（307）：307ra152.

[17]Ling Z，Li Z，Liu X，et al.Altered Fecal Microbiota Composition Associated with Food Allergy in Infants[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（8）：2546-2554.

[18]Chen CC，Chen KJ，Kong MS，et al.Alterations in the gut microbiotas of children with food sensitization in early life[J].Pediatr Allergy Immunol，2016，27（3）：254-262.

[19]王鐵柱.從腸道菌群角度探討溫通方對過敏性哮喘大鼠的治療作用[D].北京：北京中醫藥大學，2017.

[20]鄉世健，盛華芳，呂亞梅，等.冬病夏治方穴位貼敷對哮喘豚鼠氣道炎癥及腸道菌群的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（9）：95-102.

[21]夏永良，王彩霞，李德新.哮喘緩解期從脾論治機理的研究[J].中醫藥學刊，2003，21（7）：1194-1196，1199.

[22]蔡潤清，吳偉平.支氣管哮喘緩解期從脾論治80例臨床探討[J].貴陽中醫學院學報，2007，29（2）：29-30.

[23]熊英，沈楚楚，樊璞，等.捏脊法對脾虛哮喘大鼠腸道菌群和肺部炎癥的影響[J].中醫雜志，2018，59（1）：61-65.

[24]馬祥雪，王鳳云，符竣杰，等.基于腸道菌群的中醫健脾方劑作用機制的研究現狀與思考[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（5）：210-215.

（2020-08-27收稿 責任編輯：徐穎）