KL- 6在非小細胞肺癌術后輔助治療性肺損傷中的診斷價值

吳麗娜，高 弋，李沃松，劉 勇，秦曉松

中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科，沈陽 110004

肺癌的發病率和死亡率居惡性腫瘤首位，由于早期無明顯癥狀，多數患者確診時已處于中晚期，失去了最佳治療時機，5年總生存率僅為19.7%[1]。近年來，隨著手術方式的改進，術后放化療、靶向治療、免疫治療[2]等快速發展，肺癌患者的生存期及生活質量有望得到進一步改善。但放化療在殺滅腫瘤細胞的同時，對機體正常組織也會造成損傷，如化療藥物導致的藥物性肺損傷(drug induced lung injury,DILI)[3]及放療導致的放射性肺損傷(radiation induced lung injury,RILI)[4]是肺癌患者術后輔助治療的常見并發癥，如不及時診斷與治療，可發展為肺間質纖維化，嚴重者可因呼吸衰竭而死亡。

涎液化糖鏈抗原- 6(kreb von den lungen- 6,KL- 6)是分子量約為200 kD的大分子量黏液糖蛋白，生理狀態下主要表達于Ⅱ型肺泡上皮細胞、細支氣管上皮細胞，具有促進肺纖維細胞存活、遷移和增殖的作用，有望成為特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的藥物治療靶點[5- 6]。與目前應用的肺損傷診斷、病情監測工具如高分辨率計算機斷層掃描(high resolution computed tomography,HRCT)、支氣管鏡檢查、肺活檢、連續肺功能測試等相比，血清KL- 6檢測具有創傷小、費用低、結果準確、可重復檢測等優點。目前血清KL- 6在肺癌輔助治療性肺損傷中的研究主要集中于日本人群，已有文獻報道血清KL- 6的表達存在種族差異[7]。本研究以206例原發性非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者為研究對象，旨在探討血清KL- 6在中國人群NSCLC患者術后輔助治療性肺損傷中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組

1.1.1 研究對象

本研究為回顧性分析，以NSCLC患者(包括術后采用輔助治療者和僅手術者)及健康成人為研究對象。NSCLC術后輔助治療、NSCLC手術患者分別來自2017年11月—2020年7月中國醫科大學附屬盛京醫院腫瘤科和胸外科，健康成人來自同期中國醫科大學附屬盛京醫院體檢中心(健康對照組)。

輔助治療性肺損傷診斷標準如下。DILI診斷標準[8]：(1)有致肺損傷藥物攝入史；(2)有藥物致肺損傷的臨床表現，且可排除其他原因；(3)影像學證實肺部有間質性肺損傷改變；(4)停止化療后患者臨床表現得到改善。RILI診斷標準[4]：(1)有肺部放療史；(2)肺部有相應的影像學改變，其中1級RILI僅有影像學改變，≥2級伴有咳嗽、氣短、發熱等臨床癥狀；(3)排除其他原因導致的肺損傷。遵循上述診斷標準，由兩名肺部腫瘤高年資醫生、一名呼吸放射高年資醫生共同完成DILI、RILI的診斷。

NSCLC患者納入標準：(1)NSCLC的診斷標準符合《中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南2019》[9]，且經術后組織病理活檢證實；(2)TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期；(3)術后輔助治療患者耐受性較好，可接受化療、放療，具體治療方法符合指南規定[9]；(4)行肺癌切除術患者手術方式包括胸腔鏡解剖性肺切除聯合肺門縱隔淋巴結清掃術、機器人輔助解剖性肺切除聯合肺門縱隔淋巴結清掃術。排除標準：(1)合并精神疾病或認知功能低下，無法配合治療者；(2)除NSCLC外，合并其他惡性腫瘤、重要器官功能障礙、全身感染患者。

健康對照組納入標準：(1)表觀正常，自覺無身體不適；(2)年齡、性別與NSCLC術后輔助治療患者匹配；(3)肺部HRCT結果正常，無呼吸系統疾病。排除標準：存在精神疾病、認知功能障礙、結締組織病、惡性腫瘤及各系統重大疾病者。

1.1.2 肺癌患者篩選流程

NSCLC術后輔助治療組患者血清標本來自檢驗科與腫瘤科共同建立的肺癌術后輔助治療患者血清標本庫；首先從該庫中篩選肺損傷患者(肺損傷組)，隨機選取與肺損傷組患者性別、肺癌分型、TNM分期及術后輔助治療方式無統計學差異，且年齡相近的無肺損傷患者為無肺損傷組。然后隨機選取性別、肺癌分型、TNM分期與肺損傷組、無肺損傷組患者無統計學差異，且均在術前、術后7～10 d采集靜脈血的僅手術患者為NSCLC手術組。

本研究已通過中國醫科大學附屬盛京醫院倫理審查委員會審批(審批號：2018PS018J)。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集時間及血清KL- 6檢測

肺損傷組于肺損傷確診當日，無肺損傷組于輔助治療第3～4個月，NSCLC手術組于術前與術后7～10 d，健康對照組于體檢當日，采集空腹靜脈血3.0 mL，3500g離心10 min，分離血清于-70 ℃冷凍保存。采用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀集中進行血清KL- 6檢測。試劑盒由日本積水醫療株式會社生產，購于積水醫療科技(中國)有限公司。檢測方法為膠乳凝集法。根據試劑盒說明書，正常健康成人血清KL- 6的參考區間為105.3～401.2 kU/L。

1.2.2 樣本量估算及偏倚控制

本研究根據兩獨立樣本均值比較的樣本量計算公式：n1=n2=2[(uα+uβ)/(δ/σ)]2+1/4uα2，其中δ為兩總體KL- 6均數的差值；σ為總體標準差，雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，β=0.10，uα=1.96，uβ=1.28。肺損傷組、無肺損傷組總體KL- 6均值分別約為628.02、171.62 kU/L，δ=456.40，σ=362.87，δ/σ=1.3，經計算肺損傷組和無肺損傷組所需樣本量均約為14例。NSCLC手術組、健康對照組總體KL- 6均值分別約為249.69、189.79 kU/L，δ=59.90，σ=102.25，δ/σ=0.6，經計算NSCLC手術組和健康對照組所需樣本量均約為60例。

偏倚控制：(1)血清KL- 6檢測試劑盒均購自同一公司，使用固定的儀器按照標準操作流程進行檢測；(2)血清KL- 6檢測人員均經統一培訓。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗及Q-Q圖對計量資料進行正態性檢驗。符合正態分布的計量資料(年齡)以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析；不服從正態分布的計量資料(血清KL- 6)以中位數(四分位數)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以頻數(百分數)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估血清KL- 6診斷NSCLC術后輔助治療性肺損傷的效能。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

共206例NSCLC患者及103例健康對照者納入本研究。其中肺損傷組51例、無肺損傷組52例(圖1)，NSCLC手術組103例。肺損傷組臨床表現為咳嗽23例(45.10%)、呼吸困難21例(41.18%)、發熱11例(21.57%)、無癥狀3例(5.88%)。無肺損傷組無癥狀51例(98.08%)，呼吸困難1例(1.92%)。4組性別(P=0.926)、合并結締組織病(P=0.166)無統計學差異，年齡(P<0.001)、合并慢性阻塞性肺疾病(P=0.037)存在統計學差異；肺損傷組、無肺損傷組、NSCLC手術組病理類型(P=0.634)、TNM分期(P=0.756)無統計學差異；肺損傷組、無肺損傷組輔助治療方式(P=0.780)無統計學差異，見表1。

表1 患者一般資料比較

2.2 血清KL- 6比較

單因素方差分析顯示，血清KL- 6在各組間差異有統計學意義(P<0.001)。進一步組間比較顯示，血清KL- 6由高至低依次為肺損傷組[512.40(322.30，819.20)kU/L]、NSCLC手術組(術前)[204.40(162.70，283.20)kU/L]、健康對照組[177.70(154.20，206.40)kU/L]、無肺損傷組[147.80(114.25，229.80)kU/L]和NSCLC手術組(術后)[143.80(111.90，247.80)kU/L]。除無肺損傷組與NSCLC手術組(術后)血清KL- 6無統計學差異(P=0.879)外，其余兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖2。

圖 1 NSCLC患者術后輔助治療性肺損傷組、無肺損傷組患者篩選流程圖

2.3 NSCLC術后輔助治療性肺損傷診斷界值的初步建立

ROC曲線分析顯示，以無肺損傷組患者為對照，血清KL- 6診斷NSCLC術后輔助治療性肺損傷的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.972(95% CI：0.948～0.997)，靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95% CI：73.0%～94.1%)、96.2%(95% CI：86.2%～98.7%)、22.43(95% CI：5.74～87.69)、0.14(95% CI：0.07～0.28)，最佳診斷臨界值為310.15 kU/L(圖3)。

圖 2 患者血清KL- 6水平比較

圖 3 血清KL- 6診斷NSCLC患者術后輔助治療性肺損傷的ROC曲線圖

3 討論

本研究對NSCLC手術患者、NSCLC術后輔助治療患者及健康成人的血清KL- 6進行了比較，發現NSCLC術后輔助治療性肺損傷患者的血清KL- 6顯著高于輔助治療后無肺損傷的患者、NSCLC手術患者及健康對照人群。ROC曲線分析顯示，血清KL- 6診斷NSCLC術后輔助治療性肺損傷的AUC為0.972(95% CI：0.948～0.997)，靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95% CI：73.0%～94.1%)、96.2%(95% CI：86.2%～98.7%)、22.43(95% CI：5.74～87.69)、0.14(95% CI：0.07～0.28)，最佳診斷臨界值為310.15 kU/L。

肺癌患者術后輔助治療性肺損傷包括由化療引起的DILI及由放療導致的RILI，均屬于間質性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)，主要累及肺泡壁，表現為Ⅰ型肺泡上皮細胞受損脫落，Ⅱ型肺泡上皮細胞異常增生。影像學檢查可見彌漫性浸潤陰影，肺活檢病理示彌漫性肺實質、肺泡炎癥和間質纖維化[10]。肺損傷患者的肺功能進行性降低，不僅嚴重影響生活質量，且患者可因呼吸衰竭而死亡，極大程度縮短了生存期。因此，早期發現并及時治療對提高患者的生活質量、延長生存時間至關重要。目前，臨床尚缺乏間質性肺損傷診斷的血清學標志物，HRCT是DILI、RILI診斷及病情監測的常用手段，但部分疾病如結核分枝桿菌感染、肺癌等，肺部HRCT表現與DILI、RILI影像學改變類似，單純依據HRCT易誤診；另一方面，HRCT具有輻射性，不適于NSCLC患者短期內病情的連續監測。因此，探究來源于Ⅱ型肺泡上皮細胞的血清生物標志物在NSCLC患者術后輔助治療性肺損傷診斷中的應用價值具有重要作用。KL- 6是一種主要在Ⅱ型肺泡上皮細胞和細支氣管上皮細胞中表達的高分子量黏液糖蛋白，DILI、RILI時肺泡基底膜受損，Ⅱ型肺泡上皮細胞為修復損傷而增生，導致KL- 6生成增多并通過受損的基底膜進入血液。因此，血清KL- 6作為間質性肺損傷的特異性標志物，在各種以Ⅱ型肺泡上皮細胞增生為特征的ILD如IPF、膠原血管病相關間質性肺炎、超敏性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺結節[7]及嚴重急性呼吸綜合征所致肺損傷[11- 13]的診斷、病情嚴重程度評估及治療效果監測中具有重要價值。另有研究報道，血清KL- 6是預測依維莫司致肺損傷的生物標志物[3]，亦可準確預測放射性肺炎的發生及評估治療療效[14- 15]。對于RILI、DILI，既往研究認為血清KL- 6是可靠的血清生物標志物之一，但其研究對象主要為日本人群[7]，目前缺乏KL- 6在中國人群NSCLC術后輔助治療性肺損傷診斷價值的相關研究。

本研究結果顯示，肺損傷組血清KL- 6升高最為顯著，且與其他組比較均有統計學差異，提示血清KL- 6在NSCLC術后輔助治療性肺損傷中具有診斷價值；進一步以無肺損傷組為疾病對照組，通過ROC曲線評估其診斷輔助治療性肺損傷的臨床價值，結果顯示血清KL- 6診斷NSCLC術后輔助治療性肺損傷的AUC達0.972，且靈敏度和特異度均較高，提示其具有較高的診斷效能，與既往報道的血清KL- 6診斷ILD的靈敏度約為70%～100%相符[7]。

本研究ROC曲線分析顯示，血清KL- 6診斷NSCLC術后輔助治療性肺損傷的最佳診斷臨界值為310.15 kU/L，該診斷臨界值在本研究所使用試劑盒說明書提供的正常參考區間范圍內。既往文獻報道，血清KL- 6表達水平存在種族差異[7]。本研究所使用的血清KL- 6檢測試劑盒說明書提供的參考區間來源于日本人群，是否適用于中國人群尚未可知。為減少偏倚、使結果更客觀，本研究團隊基于納入的健康對照人群數據，初步建立中國東北地區50歲以上健康成人的血清KL- 6參考區間為112.90 ～311.52 kU/L，其上限值顯著低于試劑盒說明書提供的參考區間上限值，且與本研究確定的最佳診斷臨界值310.15 kU/L基本一致。

有文獻報道，KL- 6在肺癌細胞中高度表達，其在肺癌患者中的陽性率約為30%～70%[5,16- 19]。本研究NSCLC手術組(術前)血清KL- 6水平高于健康對照組，與KL- 6在肺癌中的高表達有關；生理情況下，Ⅱ型肺泡上皮細胞、細支氣管上皮細胞是KL- 6的主要產生部位，NSCLC手術組(術后)與NSCLC術后輔助治療無肺損傷組患者的血清KL- 6水平顯著低于健康對照組，可能與其肺葉切除有關。

研究的局限性：(1)本研究為單中心、單因素回顧性研究，入選病例均為TNM分期Ⅱ～Ⅲ期的NSCLC患者，需擴大肺癌人群進一步探討。(2)肺損傷患者的HRCT表現較一致，嚴重肺纖維化的患者較少，無法探究血清KL- 6與肺損傷嚴重程度的關系。(3)文獻報道顯示，ILD發病后患者血清KL- 6水平與基線(治療開始)的比值可預測表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療的晚期NSCLC患者預后[20]。本研究未對患者進行動態監測，無法判斷血清KL- 6在NSCLC術后輔助治療性肺損傷患者預后預測中的作用。

綜上，NSCLC術后輔助治療性肺損傷患者血清KL- 6顯著升高，其在NSCLC術后輔助治療性肺損傷診斷中具有較高的應用價值，但仍需大樣本前瞻性研究進一步驗證。

作者貢獻：吳麗娜、秦曉松負責研究設計、數據分析、論文撰寫；高弋、李沃松負責標本留取及臨床資料收集；劉勇指導研究設計、數據分析及修改論文。

利益沖突：無