基因差異表達分析方法及其在作物遺傳育種中的應用探討

武 浩，李 猛

（信陽農林學院，河南 信陽 464007）

作物遺傳育種是農業科學的主要學科之一，在現代農業種植中，要求利用作物遺傳育種的專業知識和技能，研究作物生長發育規律同外界環境的相互關系，通過改變農作物的生產環境、種植制度等，探尋讓作物高產、優質、高效的理論和措施。通過近30年的探索，當前中國在作物遺傳育種方面已取得了一定的成就。

1 基因差異表達分析方法

1.1 差減雜交分析方法

該方法也叫做扣除雜交或是減法雜交，主要是對2種遺傳背景大致相同而性狀有所差異的材料開展的基因差異表達分析方法。差減雜交分析方法通過將試驗作物的基因組DNA或者是aRNA經特定的核酸限制性內切酶消化后，在一定的條件下實現作物分子雜交，將2種作物相同的基因去除，取得雜交后的復合物，由此構建起差減文庫，得到更加滿意的作物基因分子。差減雜交分析方法已經在藏紅花苷合成特異性表達中得到了應用，其所具有的較高的靈敏度，可以確保有效監測到藏紅花苷的轉錄豐度情況[1]。

1.2 mRNA差異顯示逆轉錄PCR

該方法是根據成熟作物的mRNA具有的特性展開的基因差異表達分析，其主要是通過含oligo（dt）n的寡聚核苷酸作為錨定引物，通過逆轉錄酶的催化作用，滯后完成對2種成熟作物的差異表達基因的篩選。該方法成熟、效率高、靈敏度高，對不同品種作物的基因差異性表達篩選具有重要的應用意義。

1.3 cDNA代表性差異分析方法

該方法是基于DNA代表性差異分析方法基礎提出的，能夠對2種農作物的cDNA進行有效的試驗分析，通過對比分析實驗組和對照組的擴增子來完成雜交處理，最終得到差異性產物[1]。同時在cDNA代表性差異分析技術方式下，作物之間的遺傳差異可以通過普通瓊脂糖凝膠檢測差異表達條帶表示出來，具有淺顯易懂的優點。當前已經有學者借助該方法成功對分離大豆的不同萌發期子葉中的差異表達基因進行了表達和克隆研究。

1.4 表達系列標簽

該技術是20世紀90年代中期提出，通過限制性酶切含有生物素標記的cDNA，產生能夠代表其相應轉錄物的cDNA短標簽，由此完成短標簽之間的隨機鏈接和測序分析。分析需要借助sage軟件，完成對標簽的豐度的定量化分析，得到轉錄體表達水平的量化處理。表達系列標簽可以用于在雜交水稻的雜種優勢分析，能夠找到不同雜交水稻的基因序列以及進行準確的基因組標記[2]。

1.5 轉錄組測序技術

該技術是基于轉錄組和測序技術基礎上發展起來的基因差異表達分析方法。轉錄組是指特定組織或細胞在某一發育階段或功能狀態下轉錄出來的基因，其能夠將不同作物的一個發育階段下所有的RNA都表達出來。而后利用高通量技術對這些RNA的總和進行測序分析，進行RNA的重新過濾和組裝，并且通過對合成的cDNA作末端修復，完成PCR擴增，構建全新的、全面的測序文庫，利用相應的測序平臺完成作物序列測定，篩選并且得到新的作物基因序列等，由此掌握作物的生物信息。轉錄組測序技術具有較高的靈敏度，能夠同時獲得作物組織內的全部轉錄本，為作物后續的基因克隆和功能驗證奠定基礎。

2 基因差異表達分析方法在作物遺傳育種中的應用

2.1 基因差異表達分析方法的應用特點

伴隨著生物技術的發展，上述基因差異表達分析方法的篩選手段各有優勢，其在作物遺傳育種中的應用效果不同，獲得的差異表達基因的數量、速度、效率都存在差異。當前實現基因差異表達分析方法在作物遺傳育種中的應用，必須熟練掌握不同的基因差異表達分析方法的優缺點。通過其檢測表達豐度、是否基于PCR、是否可以同時檢測多組材料、是否需要測序以及是否需要預先知道作物基因序列等進行分析，不同方法間的差異下表1所示。

表1 不同基因差異表達分析方法應用特點比較Tab.1 Comparison of application characteristicsof different gene differential expression analysis methods

2.2 基因差異表達分析方法在作物遺傳育種中的應用

2.2.1 在農作物農藝性狀方面的應用

農藝性狀主要是指農作物生長期、產量、株高等可以代表作物外觀特征的指標，是農作物經濟性的重要考量指標。基因差異表達分析方法可以借助轉錄組測序技術，對作物的的農藝性狀相關基因進行篩選和測序分析，由此得到與農藝性狀相關的基因片段，為作物農藝性狀的基因片段的改良奠定基因基礎。

2.2.2 在農作物品質性狀方面的應用

隨著農作物新品種栽培技術的不斷革新，物質水平的提升，當前人們對于農作物的品質要求越來越高，不僅僅追求農作物的數量，對作物營養、口感等提出更高要求。因此，完成對農作物的外觀品質和營養品質的遺傳育種至關重要。而借助基因差異表達分析方法可以有效地進行不同作物品種差異表達基因的分析，對2個親本的作物基因組進行混樣相比，從中找到影響作物品種的基因片段，為后續的基因功能驗證和育種應用奠定了基礎。例如，影響作物營養品質的因素包括作物中的可溶糖等碳水化合物、蛋白質和脂肪酸等，不同加工方式對這些營成分的影響不同，利用基因差異表達分技術分析作物中的淀粉合成的相關基因情況，能夠發現其相關基因的表達模式，為后續的作物加工提供更加科學的農業加工技術方式，保障作物的營養品質[2]。

3 結語

綜上所述，基因差異表達分析方法能夠更好地篩選出具有優異基因的作物，已成為農作物種植的重要技術手段。