超高效合相色譜在獨一味有效成分測定中的應用＊

靳貴林，邊 洋，李 雪

（1.西藏藏醫藥大學 藏醫藥基礎教育部重點實驗室，西藏 拉薩 850000；2.西安交通大學，陜西 西安 710000）

2015 版《中國藥典》收載獨一味為唇形科植物獨一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分[1]。獨一味(Lamiophlomis herba)藏藥名“達巴”；《度母本草》：“莖方形，如標尺，葉圓形，有疣狀腺點，鋪地而生；治療月經過多，尿閉等癥，葉子搗碎涂于傷口，可促進傷口愈合。”《晶珠本草》：“葉圓而厚，莖方，花分紫、黃、白”。現代藥理研究顯示獨一味對于牙齦炎具有很好的療效[2-3]，對于骨折患者具有鎮痛止血作用[4-5]，對于肩周炎、腰腿痛患者具有明顯的鎮痛效果[6-7]。乙永林[8]認為獨一味中桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量較高可以作為獨一味質量評價的指標性成分。郝自新[9]研究提示山桅苷甲酯、8-0-乙酰山桅苷甲酯色譜分離較好，可以作為質量評價指標性成分。昝珂[10]研究顯示山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素、綠原酸、蘆丁、毛蕊花糖苷、槲皮素等化學成分含量較高，峰位明顯。綜上所述，以山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素為指標性成分，可以更好地評價獨一味質量的優劣。

超高效色譜是一種新的分析方法，廣泛用于藥物分析和分離[11,12]。超高效色譜中的流動相是超臨界二氧化碳，具有氣體的擴散特性和液體的密度和流動性[13,14]。在超臨界狀態下，液態二氧化碳具有較高的分離效率[15,16]。UPC2還具有許多其他優點，例如分析時間短，提取與分離集成在一起，對環境的危害較小[17,18]。最終，UPC2進行了3D 全波長掃描以確定化合物含量，從而克服了單波長檢測的局限性。現在，關于獨一味的質量評價的報道很多，但是沒有基于UPC2的質量評價的詳細研究[19,20]。本課題引進新技術超高效合相色譜法，以3D 全波長掃描能夠更好地測定各化學成分含量；以山桅苷甲酯為指標性成分，旨在用新技術來建立獨一味多指標質量評價分析方法。

1 儀器及供試藥材

1.1 儀器與試劑

Waters 超高效合相色譜

水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司；220v、50HZ1.5KW型號：WB-2000）

旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）

超聲儀器（江蘇昆聲市超聲儀器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）

AT.Lichom C18 液相分析色譜柱（250mm×4.6mmid.5um）

電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204-IC）

CO2（食品級9999）

甲醇（山東禹王實業有限公司化工分公司，生產批號：20180373013）

乙腈（山東禹王實業有限公司化工分公司，生產批號：20180514268）

磷酸（天津市大茂化學試劑廠，生產批號xk13-011-00027）

山桅苷甲酯（中國食品藥品鑒定研究院，CAS:623-65-8，批號：61222202）

1.2 藥材

2019 年，從西藏林芝采集了五批獨一味藥材，并經甘肅中醫藥大學楊扶德教授鑒定為正品獨一味，藥材信息見表1：

表1 藥材信息

2 實驗部分

2.1 色譜條件

以CO2與甲醇為流動相梯度洗脫，15%甲醇0～1min，18%甲醇1～5min，20%甲醇5～6min，25%甲醇6～7min，30%甲醇7～8min，30%甲醇8～9min，15%甲醇9～10min。柱溫，30℃；3D 全波長掃描，進樣量1μL、2μL、3μL、4μL、5μL；色譜圖如圖1 所示，經分析進樣量為2μL 色譜圖較好。

圖1 色譜圖

2.2 供試品制備

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，置于150mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱重加甲醇補充減少量，濾過，取續濾液10mL定容于10mL 容量瓶,待用。

2.3 對照品制備及成分確定

取山桅苷甲酯5mg，置于25mL 容量瓶，用甲醇溶解，定容于25mL,即得0.2mg/mL 的標準品溶液,待用。

2.4 標準曲線繪制

取濃度為0.0015mg/mL、0.003mg/mL、0.0045mg/mL、0.006mg/mL、0.0075mg/mL 山桅苷甲酯標準品溶液，進樣2μL 在3D 全波長掃描下進樣，計算峰面積，以峰面積為y 軸，樣品量為x 軸制作標準曲線。得出山桅苷甲酯標準曲線及r 值見表2。

表2 標準曲線及r 值

2.5 精密度實驗

以山桅苷甲酯為特征性成分來檢測精密度，取已知濃度的山桅苷甲酯溶液2μL，進樣6 次，計算得RSD 值小于2%，故而儀器的精密度較好。

2.6 穩定性實驗

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項下提取。提取液用0.25μm 濾膜過濾，在1h、4h、7h、10h、16h、24h分別進樣2μL，在3D 全波長掃描下測定山桅苷甲酯峰面積，依據峰面積計算含量，得山桅苷甲酯在24h 內RSD 值為1.5%穩定性較好。

2.7 重復性實驗

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項下提取。提取液用0.25μm 濾膜過濾，重復以上實驗6 次，分別進樣2μL，在3D 全波長掃描下測定山桅苷甲酯峰面積，計算山桅苷甲酯含量，計算得RSD 值小于2%，故而得出實驗重現性較好。

2.8 加樣回收實驗

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項下提取。提取液用0.25μm 濾膜過濾，各加入已知濃度的山桅苷甲酯對照品溶液0.3ug，而后定容于10mL 容量瓶。重復以上實驗5 次，用0.25μm 濾膜過濾，取2μL,進樣測定山桅苷甲酯面積計算加樣回收率，其值見表3。

表3 加樣回收率數值

由表3 可知，平均加樣回收率為95%，RSD 值小于2%，故而加樣回收率較好。

3 獨一味中山桅苷甲酯峰位確定

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，置于50mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱重加甲醇補充減少量，濾過，濃縮，而后定容于10mL 容量瓶。用0.25μm 濾膜過濾，取2μL 進樣，得供試品色譜圖如圖2 所示；

圖2 峰1 為山桅苷甲酯峰

4 最佳提取方式選擇

4.1 提取溶劑的選擇

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，置于150mL 的6 個帶塞錐形瓶，其中5 個錐形瓶中各自加入50%、60%、70%、80%、100%甲醇各50mL，一個錐形瓶中加入50mL 甲醇，稱定重量。超聲提取90min，計算山桅苷甲酯的含量見表4。

表4 提取溶劑考察

由表4 可知，甲醇提取液中所含山桅苷甲酯含量最高，故而選取獨一味的最佳提取溶劑為甲醇。

4.2 提取料液比選擇

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.00g，分別置于4 個150mL 的帶塞錐形瓶，分別加入70%乙醇30mL、40mL、50mL、60mL，稱定重量。分別超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱重加70%乙醇補充減少量，濾過，而后取續慮液10mL于容量瓶中。用0.25μm 濾膜過濾，取2μL 進樣，計算獨一味中山桅苷甲酯含量見表5。

表5 不同料液比下山桅苷甲酯含量

由表5 分析可知，在料液比為1:3 的情況下山桅苷甲酯的含量最高，故而選擇最佳料液比為1:3提取獨一味中的山桅苷甲酯。

4.3 超聲提取時間的選擇

精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2h 的獨一味供試品1.01g，分別置于6 個150mL 的帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱定重量。分別超聲提取30min、50min、60min、80min、120min、150min，置于室溫下冷卻，稱重加甲醇補充減少量，濾過，而后取續慮液10mL 于容量瓶中。用0.25μm 濾膜過濾，取2μL 進樣，計算獨一味中山桅苷甲酯含量見表6：

表6 不同超聲提取時間下山桅苷甲酯含量

由表6 可知超聲提取90min，提取液中的山桅苷甲酯含量較高，故而選擇超聲提取時間為90min。

5 獨一味中所含山桅苷甲酯含量的測定

精密稱取不同月份過40 目篩，60℃下干燥2h的獨一味供試品1.00g，按月份編號，每個供試品平行3 次，置于50mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱重加甲醇補充減少量，濾過，而后定容于10mL 容量瓶。用0.45μm 濾膜過濾，取2μL 進樣，計算獨一味中山桅苷甲酯的含量，其值見表7；

表7 山桅苷甲酯含量

由表7 可知該方法可以有效而準確的測出獨一味中山桅苷甲酯的含量，山桅苷甲酯含量在0.53±0.041mg/g 范圍內波動。

6 結論

獨一味(Lamiophlomis herba)藏藥名“達巴”；《度母本草》：“莖方形，如標尺，葉圓形，有疣狀腺點，鋪地而生；治療月經過多，尿閉等癥，葉子搗碎涂于傷口，可促進傷口愈合。”超高效色譜中的流動相是超臨界二氧化碳，具有氣體的擴散特性以及液體的密度和流動性，在超臨界狀態下，液態二氧化碳具有較高的分離效率。UPC23D 全波長掃描克服了單波長檢測的局限性，且具有分析時間短，提取與分離一體化，對環境無害等優點。在這項研究中，建立了一種基于UPC2的新的定量分析方法，用于評價獨一味的質量品質。