織金縣瑪瑙紅櫻桃褐腐病病原菌的鑒定

安星宇李海黃露李淳吳石平

(1.貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.織金縣植保植檢站，貴州 織金 552100)

櫻桃(Prunus avium L.)果實色澤紅艷，味道甘甜而微酸，深受消費者的喜愛。近年來，隨著我國人民消費水平不斷提高，櫻桃消費量呈現快速增加的趨勢[1]。櫻桃最早起源于我國，已經有3000多年的栽培歷史，目前廣泛分布于我國西南及華北地區[2]，國內櫻桃產量由2014年的3.45萬t上升到2018年的80余萬t，4a間增長超過20多倍，使得我國超越土耳其，成為世界第一大櫻桃生產國[3]。貴州屬于亞熱帶季風氣候，非常適于喜高溫、高濕的櫻桃生長。目前，貴州省櫻桃種植區主要分布在中部、西北部和北部，包括貴陽市、安順市、畢節市和遵義市，櫻桃作為特色果樹產業，在貴州農業產業結構調整的大背景下，種植規模得到迅速擴大[4]。至2020年，全省櫻桃總種植面積高達3.48萬hm2，同比增長6.72%。然而隨著櫻桃種植面積的擴大，病蟲害的危害程度也日益加重，其中危害櫻桃葉、花、新梢、果實的褐腐病在貴州種植區發生嚴重，嚴重影響了當地櫻桃的產量和品質，成為櫻桃生產上的主要病害之一[5]。櫻桃褐腐病又稱菌核病、灰腐病等，是一種世界性病害，目前該病害在我國山東、江蘇、陜西、浙江等地均有發生[6]。目前，我國所報道的櫻桃褐腐病均由鏈核盤菌屬(Monilinia spp.)侵染所引起，分別為核果鏈核盤菌(Monilinia laxa)、美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)和果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena)3個種[7]，三者侵染部位存在差異，但均能侵染果實，致使果樹產量及品質受到影響[8]。大量研究發現，該病菌還可危害桃、杏、李、梅等核果類果樹[9]。

“瑪瑙紅”是貴州省內最為暢銷的櫻桃品種，其是貴州本地選育而成的地方優良早熟品種，以其熟透的果子紅中透紫，像晶瑩剔透的紅瑪瑙而得名[10]。“瑪瑙紅”櫻桃果形心臟形，紫紅艷麗，風味佳，品質上乘，可溶性糖含量達到11.88%，每100g果肉中的維生素C含量更是高達22.578mg，憑借高含量的糖、酸、維生素C，享譽“中國南方櫻桃之王”之稱[11]。近年來，“瑪瑙紅”在畢節織金縣、大方縣、赫章縣以萬畝的速度推進種植，其中，織金縣規模化種植面積達2666hm2以上，櫻桃總產量更是逐年提升，為當地農業經濟注入了新的活力。然而，褐腐病所引起的果實腐敗已成為當地政府和果農亟需解決的重要問題。目前，相關科研者已對貴州櫻桃病蟲害發生的種類及危害現狀進行了一定的調查研究，但貴州櫻桃褐腐病的病菌分離鑒定未見報道，不能確定貴州櫻桃褐腐病的病原菌種類。因此，本研究對貴州櫻桃主產區織金縣的褐腐病進行病菌分離、鑒定，明確了當地褐腐病病菌種類，為櫻桃褐腐病的有效防控提供了理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品

“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病病樣于2020年5月采集于貴州省織金縣櫻桃種植園。

1.1.2 試驗試劑及儀器

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、2×Bench TopTMTaq Master Mix(倍沃醫學科技有限公司)、DNA marker D2000(天根生化科技有限公司)；離心機(賽默飛世爾科技公司)、PCR儀(美國伯樂公司)、DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.1.3 培養基

水瓊脂培養基(WA)：將15g瓊脂粉加入到1000mL蒸餾水中，自然pH，121℃下滅菌20min，倒入滅過菌的培養皿中，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：將200g去皮的馬鈴薯切片，用蒸餾水煮沸，經紗布過濾后，定容至1000mL，加入18g瓊脂粉以及18g葡萄糖，自然pH，121℃下滅菌20min，倒入滅過菌的培養皿中，備用。

1.1.4 引物

選用真菌內轉錄間隔區(internal transcribed sequence,ITS)通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增，該對引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

在顯微鏡下觀察病樣，挑取褐腐病菌的分生孢子，加入到無菌水中，制成孢子懸浮液，然后將孢子懸浮液吸取至水瓊脂平板上進行涂布。培養24h后，在顯微鏡下將已經萌發的孢子轉接到PDA培養基上，25℃培養5～7d，最后進行純化，并分別保存在4℃及-80℃冰箱中。

1.2.2 病原菌的鑒定

對分離純化的病原菌進行形態學觀察，記錄其形態特征。通過CTAB法提取菌株DNA[12]，使用真菌通用引物ITS1和ITS4對菌株DNA的核糖體ITS序列進行擴增。25μL PCR反應體系：12.5μL 2×Bench TopTMTaq Master Mix、上下游引物各1μL、9.5μL ddH2O、1μL菌株DNA。PCR擴增程序：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35個循環；72℃延伸10min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。參照崔曉霞等[13]分析方法，通過BioEide對分離菌株及參考菌株的ITS基因的序列分別進行編輯，然后用MEGA 6.0軟件采用鄰接法進行系統發育樹構建和聚類分析，依據菌株形態特征以及分子系統學結果對菌株進行準確鑒定。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化

從圖1a可知，櫻桃褐腐病能夠在葉部引起水漬狀病斑，病斑中央為灰白色，邊緣為褐色，邊界明顯。對櫻桃樣品進行病原菌分離，在顯微鏡下發現該病菌的分生孢子呈無色、單胞，形狀為檸檬形或卵形，見圖1b。通過單孢分離，共分離得到3個病原菌株，分別命名為ytys、ytys1、ytys4。

2.2 ITS序列測定與構建進化樹

通過真菌ITS通用引物ITS1/ITS4對分離菌株進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序。通過同源性比較和構建系統發育樹，分離得到的菌株ytys、ytys1、ytys4與M.fructicola(登錄號為KX982695、MH854789、MH854846、MH855692、MH860465、MH864497)聚于同一支，同源性達到了97%，見圖2。結合其形態學特征，確定引起織金縣“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病的菌株ytys、ytys1、ytys4為美澳型核果褐腐病菌M.fructicola。

3 討論

近年來，隨著分子系統學的快速發展，形態學觀察結合分子系統學分析的鑒定方法在真菌鑒定中得到越來越多的應用[14]。本研究從具有典型褐腐病癥狀的病樣分離得到病原菌，通過形態學觀察和分子生物學技術鑒定，發現分離得到的菌株與M.fructicola高度同源，表明造成織金縣“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病的主要病原菌為M.fructicola。目前，M.fructicola已在北京、浙江、云南、遼寧、甘肅等多地發現，其能侵染桃[15]、李[16]、櫻桃[17]等薔薇科果樹，對各地水果生產造成了嚴重的威脅。本次是首次在貴州櫻桃中鑒定出該病菌，鑒于其寄主廣泛、危害嚴重等特點，應及時采取綠色高效的防治措施，科學使用低毒、低殘留農藥，加強對櫻桃園的田間管理，并結合生物防治,有效地預防和控制褐腐病的發生。此外，還應加強防范其對當地薔薇科果樹的侵染，避免造成更大的經濟損失。

隨著電商平臺的不斷發展，織金縣“瑪瑙紅”櫻桃不斷開拓市場，網絡年銷售高達8t。此外，織金縣將瑪瑙紅櫻桃產業和旅游產業相結合，形成了賞花和采摘2個旅游旺季，促進了當地經濟發展，帶領農民脫貧致富。為了有效保障當地櫻桃產業的良好發展，對當地種植區櫻桃病蟲害發生的種類進行準確鑒定是十分必要的。本研究通過對貴州櫻桃主產區織金縣的褐腐病進行病菌分離、鑒定，明確了褐腐病病菌種類，為當地櫻桃褐腐病的診斷及綜合防控提供理論依據，從而更好地促進當地農業經濟增長。