S-烯丙基-L-半胱氨酸減弱LPS誘導的肺纖維化

熊越，張暉，周艷君

（江南大學無錫醫學院，江蘇 無錫 214122）

0 引言

特發性肺纖維化（IPF）是一種以刺激性干咳和進行性呼吸困難為突出表現的慢性疾病，患者生存期較短，預后差，由于其發病機制不清，治療方法十分有限[1]。2014年研制出了針對IPF治療的兩種新藥，即吡非尼酮和尼達尼布[2]，但鑒于其不良反應及費用，一般推薦輕、中度患者使用，且治療效果有限，所以探討其他候選改善肺纖維化的藥物意義重大。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）是一種從大蒜中提取的單體化合物，已有研究表明SAC具有抗氧化、抗腫瘤、抗細胞凋亡的活性[3]，并且可降低海馬中乙酰膽堿酯酶的活性，下調NF-κB、白細胞介素-1β等的表達，從而減輕神經系統炎癥[4]，但是否具有抗纖維化活性還未明確，本文旨在研究SAC對LPS誘導的小鼠肺纖維化及炎癥的影響，從而為IPF的治療提供新策略。

1 材料和方法

1.1 試劑

S-烯丙基-L-半胱氨酸（CHNOS,CAS 21593-77-1,純度>99%）購自Target Molecule公司（中國上海）,脂多糖購自sigma。

1.2 實驗動物

C57BL/6小鼠購自南京模型動物研究中心，在江南大學實驗動物中心SPF級別條件下飼養，小鼠實驗過程得到了江南大學動物倫理委員會的批準。

1.3 LPS誘導肺纖維化

小鼠隨機分為三組，分別為對照組、LPS組、LPS+SAC組（5mg/kg）,將LPS溶于生理鹽水中，SAC溶于水、乙醇和聚氧乙烯氫化蓖麻油的比例為8：1:1的溶劑中，小鼠麻醉后氣管注射生理鹽水或者LPS(5mg/kg)，24h后腹腔內注射SAC(5mg/kg),于LPS給藥后第7收集肺泡灌洗液及肺組織標本，以便進行后續的灌洗液細胞計數、蛋白濃度測定及定量RT-PCR等。

1.4 蘇木素-伊紅（HE）染色

用4%多聚甲醛固定LPS或生理鹽水氣管給藥后第21天收集的肺組織，再經過脫水、浸蠟、包埋、切片（4mm），貼片、脫蠟后，進行HE染色，染色完成后封片，于顯微鏡下觀察，評估肺損傷程度。

1.5 支氣管肺泡灌洗液

進行肺組織取材時，在心尖取血后，用1mLPBS（pH=7.4）洗肺2次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），500g離心5min，使用紅細胞裂解液裂解灌洗液中的紅細胞，使用PBS清洗兩次后進行細胞計數，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度測定。

1.6 RNA提取和定量PCR

使用TRlzol試劑從保存于-80℃條件下的肺組織中提取RNA，再使用ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒進行反轉錄獲得 cDNA，然后進行定量 PCR，檢測 iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35表達水平。

1.7 體外細胞刺激實驗

培 養 Raw264.7細 胞，按 DMSO、DMSO+LPS、DMSO+10μM+LPS、DMSO+30μM+LPS、DMSO+50μM+LPS 分組進行給藥刺激，收集細胞樣本后進行RNA提取和定量PCR實驗，檢測 iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35表達水平。

1.8 統計分析

數據用平均數±SEM表示，采用Graph Prism8.0進行分析統計，單個比較的所有統計分析均通過t檢驗進行，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 SAC可以改善LPS誘導的肺纖維化

為了研究SAC對肺纖維化的影響，我們建立了LPS誘導的小鼠肺纖維化模型，取材后對肺組織切片進行HE染色，鏡下觀察結果顯示LPS組表現出明顯的纖維化和大量的炎細胞浸潤，肺損傷程度高。與LPS組相比，LPS+SAC組結果顯示SAC顯著降低了纖維化及炎細胞浸潤程度（圖1）。

圖1 HE染色

2.2 SAC可減輕LPS誘導的肺部炎癥

SAC具有較高的抗炎活性，而肺纖維化進展中往往伴隨著炎癥的發生，為研究SAC能否減輕肺纖維化伴隨的炎癥，我們還進行了BALF細胞計數及蛋白濃度測定。HE染色結果顯示經腹腔注射SAC的小鼠炎癥細胞浸潤明顯減少（圖1），此外，BALF細胞計數及蛋白分析結果顯示，與LPS組相比，經SAC處理的小鼠BALF總細胞減少，蛋白濃度下降（圖2和圖3），綜上說明SAC可減輕LPS誘導的肺部炎癥。

圖2

圖3

2.3 SAC可降低LPS誘導的肺纖維化相關炎癥因子表達

為研究SAC對LPS誘導的小鼠炎癥因子表達是否有影響，我們通過定量PCR技術檢測了肺組織炎癥因子的mRNA表達水平，結果顯示與LPS 組相比，SAC組的iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35等相關炎癥因子的mRNA表達水平明顯降低（圖4A-D）。另外，體外刺激Raw264.7細胞實驗結果也顯示，與LPS組相比，SAC可降低相關炎癥因子的表達（圖5A-D）。

圖4

圖5

3 討論

特發性肺纖維化（IPF）是臨床上較常見的疾病，該疾病往往導致肺功能進行性喪失[5]，會嚴重影響人體呼吸功能，死亡率高，生存期短[6]。但其發病機制比較復雜，發病原因至今未明，因此臨床上有效的藥物也很少，同時氧療、機械通氣等非治療手段效果亦不佳[7]，肺移植不能適用于所有患者，所以尋找能夠改善、治療IPF的新型藥物具有重要的臨床意義。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）是大蒜素的主要成分之一，它所具有的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性已經得到了廣泛的研究，其在肝臟和心血管疾病方面也被證實有較好的預防與治療效用[8]。但在其是否具有抗纖維化活性方面的研究還比較少，如果能證明SAC在抗纖維化方面有一定作用，將為特發性肺纖維化的治療帶來新思路。

脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌內毒素的主要成分[9]，也是肺纖維化的重要致病因素，LPS誘導肺纖維化的關鍵是促進肺成纖維細胞的活化與異常增殖[10]。肺成纖維細胞表面有一種由糖磷脂酰肌醇（GPI）錨定的糖蛋白，即胸腺細胞分化抗原-1（Thy-1）[11]，肺纖維化組織中大量的成纖維細胞表面Thy-1表達減少[Thy-1（-）]，已有研究表明[Thy-1（-）]的成纖維細胞有較強活化增殖能力，其在各種炎癥因子如iNOS、IL-6等的刺激下表現出更強的反應能力[12]。

我們構造了LPS誘導的肺纖維化小鼠模型，隨機分為對照組、LPS組、LPS+SAC組，從實驗結果中，我們可以看到LPS組中，小鼠肺泡內大量炎性細胞浸潤，加重肺損傷程度，肺組織的iNOS、IL-6、TNF-α和IL-12p35mRNA表達水平較對照組升高，而LPS+SAC組中，SAC處理使得炎性細胞浸潤程度減輕，降低了纖維化因子的表達，從而降低了肺成纖維細胞的活化增殖能力，減輕了LPS誘導的纖維化和炎癥增強狀態。

綜上所述，我們發現SAC可以顯著降低LPS誘導的肺纖維化和炎癥，同時降低相關炎癥因子的表達,我們的研究證明了SAC有潛在的抗纖維化及抗炎作用，這為IPF治療提供了一個有效的依據。