半夏野生品和栽培品中8種核苷類成分的含量測定方法建立及差異分析

張勇 李傳峰 高桂花 馬瑜 任強

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）13-1583-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.08

摘 要 目的：建立半夏野生品和栽培品中8種核苷類成分含量測定的方法，并進行兩者的差異分析。方法：采用高效液相色譜法測定20批半夏藥材（野生品YS1～YS8、栽培品ZP1～ZP12）中尿嘧啶、尿苷、肌苷、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥苷、β-胸苷和腺苷的含量;以上述8種核苷類成分含量為基礎，采用聚類分析、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學模式識別法對半夏野生品和栽培品進行綜合評價。結果：20批半夏藥材中尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷、腺嘌呤、鳥苷、β-胸苷和腺苷的含量分別為0.02～0.24、0.01～0.24、0.06～0.37、0.02～0.14、0.04～0.22、0.14～0.42、0.01～0.09、0～0.32 mg/g。經聚類分析、PCA和OPLS-DA發現，8批野生品（YS1～YS8）聚為一類，12批栽培品（ZP1～ZP12）聚為一類;半夏野生品的主要特征標志物為鳥苷、尿苷、腺苷、腺嘌呤，半夏栽培品的主要特征標志物為尿嘧啶、黃嘌呤、肌苷、β-胸苷。結論：建立了半夏藥材中8種核苷類成分的含量測定方法;以核苷類成分為質量標志物可有效區分半夏野生品和栽培品，且野生品質量優于栽培品。

關鍵詞 半夏;野生品;栽培品;核苷類;含量測定;化學模式識別法

Method Establishment for Content Determination of 8 Nucleosides in Wild and Cultivated Pinellia ternata and the Difference Analysis

ZHANG Yong，LI Chuanfeng，GAO Guihua，MA Yu，REN Qiang（School of Pharmacy， Jining Medical University， Shandong Rizhao 276826， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of 8 nucleosides in wild and cultivated Pinellia ternate， and to conduct the difference analysis. METHODS： The contents of uracil， uridine， inosine， xanthine， adenine， guanosine， β-thymidine and adenosine in 20 batches of P. ternate （wild product YS1-YS8， cultivated product ZP1-ZP12） were determined by HPLC method. Based on the contents of the above 8 nucleosides， cluster analysis， principal component analysis （PCA）， partial least squares analysis （OPLS-DA） were used to comprehensively evaluate the wild and cultivated P. ternata. RESULTS： The contents of uracil， uridine， inosine， xanthine， adenine， guanosine， β-thymidine and adenosine in 20 batches of P. ternate were 0.02-0.24， 0.01-0.24， 0.06-0.37， 0.02-0.14， 0.04-0.22， 0.14-0.42， 0.01-0.09， 0-0.32 mg/g， respectively. Cluster analysis， PCA and OPLS-DA showed that 8 batches of wild P. ternate （YS1-YS8） were clustered into one category， and 12 batches of cultivated P. ternate （ZP1-ZP12） were clustered into one category. Main characteristic markers of wild P. ternate were guanosine， uridine， adenosine and adenine， while the main characteristic markers of cultivated P. ternate were urinine， xanthine， inosine， and β-thymidine. CONCLUSIONS： The method for the content determination of 8 nucleosides in P. ternate is established. Nucleosides as quality markers can effectively distinguish wild and cultivated P. ternata， and the quality of the wild P. ternate was better than that of cultivated P. ternate.

KEYWORDS? ?Pinellia ternata; Wild product; Cultivated product; Nucleoside; Content determination; Chemical pattern recognition

半夏是天南星科多年生草本植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，其性溫味辛、有小毒，具有止咳、平喘、止吐、抗炎等多種藥理作用[1-4]。目前，半夏主要分布在四川、甘肅、山東、貴州、湖南、湖北等地[5];其主要化學成分包括核苷類、生物堿類、有機酸類、甾醇類成分及揮發油等[6-10]。隨著人類社會的不斷拓展，野生半夏資源被無計劃、掠奪性地采挖，造成野生半夏資源銳減，已經無法滿足市場的大量需求，使栽培品種成為市場上主要商品[11]。由于栽培與野生環境不同，故半夏的塊莖形態也出現了部分變異，甚至品質下降[12]，造成其在臨床上的超量使用[13]。因此，有必要對野生半夏及其栽培品進行區別。

有研究表明，核苷類成分是半夏 “降逆止嘔”的主要物質基礎[14-15]，且其具有廣泛的生理活性，是生物細胞維持生命活動的基本組成，參與 DNA 代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節、改善腦細胞代謝、鎮靜中樞神經、抗血小板凝集、抗心律失常和抗驚厥等多種生物活性[16]。在2020年版《中國藥典》（一部）中，半夏并無含量測定相關的要求，僅對其中4種氨基酸（精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸）進行薄層色譜鑒別[17];且筆者在前期預實驗中發現，采用薄層色譜法并不能鑒別野生半夏及其栽培品。因此，考慮增加半夏中核苷類成分的含量測定項以更好地評價半夏的質量。但野生半夏和其栽培品是否可通過核苷類成分進行區分尚不明確。

化學模式識別法是化學計量學的重要組成部分，也是篩選中藥質量標志物的重要數學方法，可劃分為無監督的模式識別（包括聚類分析、主成分分析）和有監督的模式識別[偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）][18]。基于此，筆者擬采用高效液相色譜法（HPLC）建立同時測定半夏中8種核苷酸類成分（尿嘧啶、尿苷、肌苷、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥苷、β-胸苷和腺苷）的含量;并以上述8種核苷類成分的含量為基礎，采用化學模式識別法分析野生半夏及其栽培品中核苷類成分差異，以期為野生半夏及其栽培品的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

1260型 HPLC儀，配有G1329B自動控溫自動進樣器、G1312B二元泵、G1362A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器（DAD）和Agilent OpenLAB CDS數據處理工作站，購自美國Agilent公司; BP121S型萬分之一電子天平購自德國Sartorius公司;KQ-500DB 型數控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司;ST8R型離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用半夏野生品和栽培品藥材采自全國7個省或直轄市，由濟寧醫學院藥學院王建安教授鑒定為天南星科植物半夏P. ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖（樣品來源信息見表1）;尿嘧啶對照品（批號C10668189，純度99%）、尿苷對照品（批號C10633868，純度99%）、肌苷對照品（批號C10443696，純度98%）、黃嘌呤對照品（批號C10830281，純度98%）、腺嘌呤對照品（批號C10492152，純度98%）、鳥苷對照品（批號C10079911，純度99%）、β-胸苷對照品（批號C10080693，純度99%）和腺苷對照品（批號C10825934，純度99%）均購自上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑為實驗室常用規格，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 半夏野生品和栽培品藥材中8種核苷類成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）;流動相為水（A）-甲醇（B）溶液，梯度洗脫（0～6 min，2%B;6～8 min，2%B→5%B;8～15 min，5%B→10%B;15～20 min，10%B→30%B;20～30 min，30%B→80%B;30～50 min，80%B;50～52 min，80%B→2%B）;采用DAD，檢測波長為265 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為5 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β-胸苷、腺苷對照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加水超聲（功率200 W，頻率50 kHz，下同）溶解后定容，制成上述8種成分質量濃度分別為101、100、99、101、99、100、99、98 μg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。另分別取上述8種成分對照品適量，加水稀釋制成質量濃度均為10 μg/mL的單一對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取半夏藥材粉末（過60目篩）1 g，精密稱定，加水10 mL，超聲提取45 min，放冷，以4 500 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 專屬性試驗 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液和“2.1.3”項下供試品溶液（編號ZP8）各5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，尿嘧啶、尿苷、肌苷、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥苷、β-胸苷和腺苷的色譜峰峰形均較好，且分離度均大于1.5，理論板數以黃嘌呤峰計不低于3 000，詳見圖1。

2.1.5 線性關系、定量限和檢測限考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品貯備液2、1、0.5、0.1、0.05 mL，置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。分別精密吸取上述系列溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以8種核苷類成分的質量濃度（x，? ? ? ?μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行回歸分析。另外，取“2.1.2”項下8種核苷類成分的單一對照品溶液，以水逐級稀釋，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限（LOQ）和檢測限（LOD），結果見表2。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β-胸苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.26%、0.31%、0.33%、0.10%、0.38%、0.39%、0.27%、0.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密稱取同一批半夏藥材粉末（編號ZP8，過60目篩），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫條件下放置0、3、6、9、12、24 h 后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β-胸苷、腺苷峰面積的RSD 分別為1.3%、0.84%、0.91%、1.1%、1.2%、0.91%、0.88%、0.83%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 精密稱取同一批半夏藥材粉末（編號ZP8，過60目篩），共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果，尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β-胸苷和腺苷的平均含量分別為0.19、0.18、0.14、0.06、0.13 、0.17、0.05、0.16 mg/g，RSD分別為1.1%、1.3%、1.5%、0.86%、1.5%、1.3%、0.98%、1.1%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的半夏藥材粉末（編號ZP8，過60目篩）6份，每份0.5 g，分別加入與樣品中待測成分含量相當的尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β-胸苷、腺苷的對照品，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.1.10 樣品含量測定 取20批半夏藥材，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下方法進樣測定，采用外標法計算8種核苷類成分的含量。每批樣品平行測定3份，取平均值，結果見表4。

2.2 化學模式識別分析

2.2.1 聚類分析 采用SPSS 25.0軟件，將20批半夏藥材中8種核苷類成分的含量作為變量，采用平方歐氏距離和組間聯接法進行聚類分析，結果見圖 2。由圖2可知，當平方歐氏距離為25時，20 批樣品聚為2類：樣品ZP1～ZP12號聚為第一類，均為栽培品;樣品YS1～YS8聚為第二類，均為野生品。由此說明，野生半夏和其栽培品中核苷類成分的含量存在明顯差異。

2.2.2 主成分分析 采用 SPSS 25.0 軟件建立20批半夏藥材的8種核苷類成分的含量數據矩陣，經標準化后，采用SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析，以特征值>1 為標準，得到2個主成分，累積方差貢獻率為79.333%（表5），表明2個主成分能較好地解釋原有變量所包含的信息;同時得到8種核苷類成分的主成分矩陣（表6）、主成分得分圖（圖3）和主成分載荷圖（圖4）。另以8種核苷類成分的含量作為變量，建立主成分分析模型，模型解釋率R2X=0.765（該值大于0.5，說明建立的模型具有較高的預測準確率[19]）。由表6可知，腺嘌呤、鳥苷和腺苷對主成分1具有較高的載荷，尿苷和β-胸苷對主成分2具有較高的載荷。由圖3、圖4可知，半夏野生品與栽培品各自聚為一類，說明不同生長條件的半夏中的核苷類成分含量存在明顯差異;野生品中鳥苷、尿苷、腺苷、腺嘌呤為其主要的特征標志物，栽培品中β-胸苷、肌苷、黃嘌呤、尿嘧啶為其主要的特征標志物。

2.2.3 OPLS-DA分析 在主成分分析的基礎上，將20批半夏藥材中8種核苷類成分的含量數據導入SIMCA 14.1軟件中，建立OPLS-DA模型（其得分圖見圖5）。結果顯示，數據矩陣模型質量參數R2X=0.95、R2Y=0.94，模型預測參數Q2=0.87（其中，R2X表示概況X矩陣的結實率;R2Y表示模型的穩定性;Q2表示模型的預測性）。三者均大于0.5，且R2X和Q2之間差距小于0.2，說明所建模型具有較強的解釋率和預測準確率[20-21]，可用于區分半夏野生品和栽培品。

2.2.4 綜合評價 參考文獻[22]方法，將“2.2.2”項下所得的主成分得分系數與標準化后的數據相乘后求和，得到兩個主成分的表達式F1、F2：F1=-0.189×Z1-0.197×Z2+0.140×Z3+0.176×Z4-0.154×Z5+0.180×Z6-0.090×Z7+0.171×Z8，F2=0.085×Z1+0.177×Z2+0.406×Z3+0.093×Z4+0.240×Z5+0.275×Z6+0.465×Z7+0.039×Z8（Z1～Z8表示8種核苷類成分含量經標準化后的數據）。以每個主成分所對應的特征值占提取主成分的特征值之和的比例作為權重，得到主成分綜合模型：H=（57.131%×F1+22.202%×F2）/79.333%;然后，根據此綜合模型計算20批半夏藥材的主成分得分及綜合得分，綜合得分越高，表明藥材質量越好[23]，結果見表7。

由表7可知，從重慶市和江西省收集的半夏野生品的綜合得分排名前8位，表明該兩地產野生半夏藥材的質量較好;也由此說明，對半夏中核苷類成分的分析，能有效地評價其質量。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本課題組采用DAD對混合對照品溶液進行了全波長掃描，結果發現，半夏藥材中8種核苷類成分的最大吸收波長均在265 nm附近，且在該波長下圖譜的基線穩定、峰形較好，故選擇265 nm作為本研究的檢測波長。

3.2 色譜條件的考察

核苷類成分極性較強，均可在C18柱上采用低有機溶劑比例的流動相洗脫[24]。本課題組比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液等流動相對半夏藥材中核苷類成分洗脫的影響，發現采用甲醇-水為流動相可達到良好的洗脫效果。本研究選擇甲醇為有機相進一步優化梯度洗脫條件，使核苷類成分在25 min內全部洗脫，其他成分在50 min內洗脫完畢，且供試品溶液中各成分分離良好。

3.3 供試品溶液制備方法的考察

本課題組在前期預實驗中選擇水、甲醇、乙醇、甲醇-水、乙醇-水等作為核苷類成分的提取溶劑，結果發現，甲醇和乙醇很難將肌苷、鳥苷提取出來，但水對肌苷和鳥苷的提取效率較高。在提取方法的選擇上，本課題組考察了回流提取法與超聲提取法，結果發現，超聲提取法的效率較高。后續本課題組又對影響超聲提取效率的功率（300、400、500 W）、頻率（30、40、50 kHz）、提取時間（30、45、60 min）等因素進行了考察，結果發現，選擇超聲功率500 W、頻率40 kHz提取45 min可將半夏中的核苷類成分完全提取。

綜上所述，本研究建立了一種同時測定半夏中8種核苷類成分含量的方法;經化學模式識別法分析后發現，以核苷類成分為質量標志物可有效區分半夏的野生品和栽培品，且野生品質量優于栽培品。

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（收稿日期：2021-02-04 修回日期：2021-05-18）

（編輯：唐曉蓮）