艾司奧美拉唑對柳氮磺吡啶在大鼠體內藥動學行為的影響

賈茹 魏世杰 張文萍 買淑霞 蔣韶婓 黨宏萬

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）13-1596-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.10

摘 要 目的：建立測定大鼠血漿中柳氮磺吡啶（SSZ）代謝產物磺胺吡啶（SP）濃度的方法，并探討艾司奧美拉唑（ESOM）對SSZ在大鼠體內藥動學行為的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機分為SSZ組和SSZ+ESOM組，每組6只。SSZ+ESOM組大鼠連續灌胃艾司奧美拉唑腸溶片[90 mg/（kg·d）]14天;第15天時，兩組大鼠單次灌胃柳氮磺吡啶腸溶片（90 mg/kg），并在給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h時于其眼內眥取血。血漿經甲醇沉淀蛋白后，以地西泮為內標，以Agilent XDR-C18為色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）為流動相，采用液相色譜-串聯質譜法檢測血漿中SSZ代謝產物SP的濃度;采用DAS 3.0.1軟件計算藥動學參數并進行組間比較。結果：SP檢測質量濃度的線性范圍為2～1 000 ng/mL，方法學考察結果符合《中國藥典》相應要求。SSZ+ESOM組和SSZ組大鼠體內SP的AUC0-t、tmax、t1/2z、cmax、MRT0-t等藥動學參數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：所建方法簡便、快速、靈敏度高，可用于血漿中SSZ代謝產物SP濃度的檢測;ESOM對SSZ在大鼠體內的藥動學行為無明顯影響。

關鍵詞 柳氮磺吡啶;磺胺吡啶;艾司奧美拉唑;液相色譜-串聯質譜法;藥動學行為

Effects of Esomeprazole on Pharmacokinetic Behavior of Sulfasalazine in Rats

JIA Ru1，2，WEI Shijie1，3，ZHANG Wenping1，3，MAI Shuxia1，JIANG Shaofei4，DANG Hongwan1，3（1. Dept. of Pharmacy， General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 2. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 3. Institute of Clinical Pharmacology， General Hospital of Ningxia Medical Universtiy， Yinchuan 750004， China; 4. Dept. of Pharmacy， Qingdao Jiaozhou Central Hospital， Shandong Qingdao 266300， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To develop a method for determining the plasma concentration of sulfasalazine （SSZ） metabolite sulfapyridine （SP） in rats， and to investigate the effects of esomeprazole （ESOM） on the pharmacokinetic behavior of SSZ in rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into SSZ group and SSZ+ESOM group， with 6 rats in each group. SSZ+ESOM group were given Esomeprazole enteric-coated tablets [90 mg/（kg·d）] intragastrically for 14 days. On the 15th day， the rats in 2 groups were given Sulfasalazine enteric coated tablets （90 mg/kg） intragastrically， and blood sample was collected from the inner canthus at 0.5， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 10， 12， 24， 36， 48， 72 h after administration. After protein precipitation with methanol， using diazepam as internal standard， Agilent XDR-C18 column was adopted with methanol-0.1% formic acid solution （gradient elution） as mobile phase. The concentration of SSZ metabolite SP in plasma was determined by LC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 3.0.1 software and compared between 2 groups. RESULTS： The linear range of SP were 2-1 000 ng/mL. The methodology met the requirements of Chinese Pharmacopeia. There was no statistical significance in pharmacokinetic parameters of SP between 2 groups， such as AUC0-t， tmax， t1/2z， cmax， MRT0-t （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established method is simple， rapid and sensitive; it can be used for the concentration determination of SSZ metabolite SP in plasma. ESOM has no significant effect on the pharmacokinetic behavior of SSZ in rats.

KEYWORDS? ?Sulfasalazine; Sulfapyridine; Esomeprazole; LC-MS/MS; Pharmacokinetic behavior

質子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPIs）因高效的抑酸作用而被廣泛用于胃腸道疾病的臨床治療。目前，PPIs除用于治療胃食管反流病、胃十二指腸潰瘍和幽門螺桿菌感染等疾病外，還被用于預防由非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）引發的胃潰瘍疾病[1]。類風濕關節炎（aheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫疾病，其特征為多關節的慢性炎癥、骨侵蝕和軟骨破壞[2]。柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SSZ）是傳統的合成類抗風濕藥物，是治療RA的基石藥物，臨床通常在使用SSZ的基礎上根據患者的病情聯合使用NSAIDs[3]。近年來，國外研究表明，SSZ聯合PPIs代表藥物艾司奧美拉唑（esomeprazole，ESOM）可協同抑制黑色素瘤和肉瘤細胞的生長和遷移;針對某些難治性腫瘤，二者聯用也顯示出一定的臨床價值[4]。此外，最新的研究結果證實，ESOM和SSZ可作為孕產婦子癇早期的備選治療藥物，兩者聯合使用后可降低可溶性血管內皮生長因子受體的分泌和內皮功能障礙標志物的水平，從而達到有效防治先兆子癇的目的[5]。

有研究指出，SSZ需在腸道細菌產生的偶氮還原酶參與下釋放出發揮藥效的磺胺吡啶（sulfapyridine，SP）和5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic，5-ASA）[6]。其中，約90%的SP在大腸被吸收，而僅有20%～30%的5-ASA被吸收，未被吸收的部分則經大便排出[7]。同時，該藥的不良反應發生率為71%，其中2/3涉及胃腸道和中樞神經系統，主要表現為惡心、嘔吐、厭食、消化不良、腹痛、頭痛、眩暈等，約20%～30%的患者因此而停藥[7-8]。SP是SSZ治療RA的有效成分，且與服用SSZ后產生的不良反應密切相關[9-11]。有學者研究認為，當臨床以SSZ治療潰瘍性結腸炎且患者體內SP血藥濃度達20～50 ?g/mL時，療效較好、不良反應較少;而當血藥濃度超過50 ?g/mL時，則易引發不良反應[7]。有研究發現，PPIs可導致腸道細菌過度生長[12-14]。那么，吸收、代謝過程受腸道菌群影響的SSZ與促進腸道細菌生長的PPIs聯用時，前者的藥動學行為是否會受后者的影響是值得探究的問題?；诖?，本文擬建立測定大鼠血漿中SSZ代謝產物SP濃度的液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），通過分別測定聯用ESOM和未聯用ESOM大鼠體內SP的血藥濃度，計算并比較兩者的藥動學參數，以進一步明確ESOM是否會對SSZ的藥動學過程產生影響，為提高SSZ的臨床療效及安全性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），API4000型串聯四極桿質譜儀及配備的電噴霧離子源、Analyst 1.5.1分析操作軟件（美國Applied Biosystems公司），Centrifuge 5804R型臺式低溫離心機（德國Eppendorf公司），VORTEX-GENIE2型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司），Mettler型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

柳氮磺吡啶腸溶片（批號09190504，規格0.25 g）購自上海信誼天平藥業有限公司;艾司奧美拉唑鎂腸溶片[批號1908009，規格40 mg（按C17H19N3O3S計算）]購自阿斯利康制藥有限公司;0.9%氯化鈉注射液（批號A20040402B，規格250 mL ∶ 2.25 g）購自四川科倫藥業有限公司;SP對照品（批號B24271，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司;地西泮對照品（內標，批號171225-101304，純度≥99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院;甲酸、甲醇均為色譜純，水為純凈水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雄性，共12只，體質量250～310 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK（寧）2015-0001。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

精密稱取SP對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液。精密稱取內標地西泮對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1 mg/mL的內標母液;用50%甲醇進一步將上述內標母液稀釋至200 ng/mL，即得內標溶液。以上所有溶液均于4 ℃下保存。臨用前，SP對照品貯備液需用50%甲醇稀釋成所需質量濃度的標準溶液。

2.2 藥液的配制

2.2.1 ESOM藥液 精密稱取研細的艾司奧美拉唑腸溶片粉末適量，用0.9%氯化鈉注射液溶解，配制成質量濃度為15 mg/mL的ESOM藥液，備用。

2.2.2 SSZ藥液 精密稱取研細的柳氮磺吡啶腸溶片粉末適量，用0.9%氯化鈉注射液溶解，配制成質量濃度為30 mg/mL的SSZ藥液，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品50 ?L，置于1.5 mL離心管中，加入50%甲醇50 ?L，渦旋2 min，然后加入內標溶液（200? ?ng/mL）50 ?L和甲醇200 ?L，渦旋5 min;于4 ℃下以14 000 r/min離心10 min，取上清液100 ?L，加水100 ?L，渦旋2 min;于4 ℃下以14 000 r/min離心2 min，取上清液，進行LC-MS/MS分析。

2.4 色譜與質譜條件

2.4.1 色譜條件 以Agilent XDR-C18（2.18 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以Shim-pack GVP-ODS（2.0 mm×5 mm，2.2 μm）為保護柱;以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.8 min，60%B;0.8～1.8 min，60%B→20%B;1.8～4 min，20%B;4～4.2 min，20%B→60%B;4.2～5 min，60%B）;流速為0.30 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為10 ?L。

2.4.2 質譜條件 以電噴霧離子源為離子源，離子噴射電壓為4.5 kV，離子源溫度為600 ℃;霧化氣流速為45 L/h，輔助加熱氣流速為45 L/h;氣簾氣（N2）壓力為14 psi，碰撞氣壓力為7 psi。以多反應監測（MRM）模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 250.1→156.0（SP）、m/z 285.3→193.1（內標），碰撞能量分別為25、43 eV，掃描時間為200 ms。SP和內標的二級質譜圖見圖1。

2.5 專屬性考察

分別取不同來源的空白血漿50 μL，用等體積的50%甲醇代替內標溶液，其余按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，得空白血漿色譜圖（圖2A）;將質量濃度為2 ng/mL的SP標準溶液加入空白血漿中，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，得到空白血漿+SP+內標色譜圖（圖2B）;取單只大鼠灌胃柳氮磺吡啶腸溶片0.5 h后采集的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，得到大鼠血漿樣品色譜圖（圖2C）。由圖2可見，SP和內標的保留時間約分別為1.2、3.3 min，內源性雜質不干擾待測成分的檢測。

2.6 標準曲線的繪制和定量下限的考察

以50%甲醇為溶劑，按“2.1”項下方法配制7個不同質量濃度的SP標準溶液;分別移取各標準溶液50 μL至1.5 mL離心管中，加入空白血漿50 μL，依次配制成SP質量濃度分別為2、5、20、100、500、800、1 000 ng/mL的系列標準血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以SP質量濃度（x）為橫坐標、SP峰面積與內標峰面積的比值（y）為縱坐標，應用加權最小二乘法（w=1/x2）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.002 97x+0.002 02（r=0.998 7）。這表明SP檢測質量濃度的線性范圍為2～1 000 ng/mL，定量下限為2 ng/mL。

以50%甲醇為溶劑，按“2.1”項下方法配制相應質量濃度的SP標準溶液;精密移取該標準溶液50 μL至1.5 mL離心管中，加入空白血漿50 μL，配制成SP質量濃度為2 ng/mL的定量下限血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積。每個分析批平行操作6個樣品、連續操作3個分析批，分別根據同批隨行標準曲線計算SP的實測質量濃度，并考察批內、批間精密度[以相對標準偏差（RSD）表示，下同]和準確度[以相對誤差（RE）表示，下同]，結果見表1。由表1可見，定量下限血漿樣品的批內、批間RSD均不超過10%，與理論質量濃度的RE均在±5%之內，符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[15]。

2.7 精密度與準確度試驗

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項下方法配制SP質量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質量濃度質控（QC）樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積。每個分析批平行操作6個樣品、連續操作3個分析批，分別根據同批隨行標準曲線計算各QC樣品的實測質量濃度，并計算其批內、批間精密度和準確度，結果見表1。由表1可見，SP低、中、高質量濃度QC樣品的批內、批間RSD均小于11%，與理論質量濃度的RE均在±5%之內，符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[15]。

2.8 稀釋可靠性考察

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項下方法配制SP質量濃度為4 000 ng/mL的高質量濃度血漿樣品，再用空白血漿稀釋5倍，按此稀釋倍數平行操作6份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積。根據同批隨行標準曲線計算樣品的實測質量濃度，并乘以稀釋倍數計算最終質量濃度，將該值與對應的理論質量濃度進行比較，用以考察精密度和準確度。結果，大鼠血漿中SP稀釋5倍后，所得樣品實測質量濃度的RSD為1.1%（n=6），與理論質量濃度的RE為-0.5%，表明稀釋可靠性良好。

2.9 提取回收率和基質效應試驗

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項下方法配制SP質量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質量濃度QC血漿樣品，每個質量濃度樣品平行制備6份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄相應峰面積（A）;將不同來源的空白血漿按“2.3”項下方法處理后，再加入相應濃度的SP標準溶液和內標溶液，使質量濃度與前者對應，每個質量濃度樣品平行制備6份，按“2.4”項下條件進樣分析，記錄相應峰面積（B）;分別配制含內標且質量濃度與前者對應的SP標準溶液，按“2.4”項下條件進樣分析，記錄相應峰面積（C）。按如下公式計算提取回收率：提取回收率（%）=A/B×100%，結果見表2。由表2可見，低、中、高質量濃度QC樣品中，SP的提取回收率（以平均值計）為86.16%～95.26%，RSD均不高于2.47%（n=6）;內標的提取回收率（以平均值計）為89.09%，RSD為14.2%（n=6）。按如下公式計算基質因子：基質因子=B/C×100%;以SP與內標的基質因子的比值作為內標歸一化基質因子，結果見表2。由表2可見，低、中、高質量濃度QC樣品的內標歸一化基質因子（以平均值計）為58.80%～62.53%，RSD不超過6.06%，符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[15]。

2.10 穩定性試驗

以50%甲醇為溶劑，按“2.6”項下方法配制SP質量濃度分別為4、80、800 ng/mL的低、中、高質量濃度QC血漿樣品，每個質量濃度樣品平行制備5份，考察其在室溫（25 ℃）存放4 h、凍融（-80 ℃～室溫）循環3次、-80 ℃冰箱保存1個月再處理以及處理后于4 ℃冰箱中存放24 h的穩定性。所有樣品均按同批隨行標準曲線計算其實測質量濃度及RSD。結果，低、中、高質量濃度QC血漿樣品在上述條件下，實測質量濃度的RSD均小于6.6%（n=5），提示樣品穩定性良好。

3 SSZ藥動學研究

3.1 動物實驗方案

將SD大鼠隨機分為SSZ組和SSZ+ESOM組，每組6只。SSZ+ESOM組大鼠每天于固定時間點灌胃15? mg/mL的ESOM藥液（給藥劑量為3.6 mg/kg[16]），每天1次，連續給藥14天;SSZ組大鼠不作處理。所有大鼠在相同環境下正常喂養，直到14天末次給予ESOM后，禁食、不禁水12 h，同時單次灌胃30 mg/mL的SSZ藥液（給藥劑量為90 mg/kg[10，16]）。分別在此次給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h于大鼠眼內眥采血（采血量約300 ?L），置于肝素抗凝管中，于4 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80 ℃保存，備用。

3.2 平均藥-時曲線的繪制及藥動學參數的計算

取“3.1”項下凍存的血漿樣品，放置至室溫，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積并按隨行標準曲線計算其血漿中SP的質量濃度（各時間點的血漿樣品需用空白血漿稀釋5倍），再采用Origin Pro 9.1軟件繪制其平均藥-時曲線，結果見圖3。

采用DAS 3.0.1軟件以非房室模型方法計算藥動學參數，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。其中，對cmax和AUC先進行對數轉化后再進行t檢驗;對tmax進行秩和檢驗，對t1/2z、MRT0-t、CLz、Vz進行t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義，結果見表3。

由表3可見，SSZ+ESOM組與SSZ組比較，各藥動學參數組間差異均無統計學意義（P>0.05），提示ESOM對SSZ在大鼠體內的藥動學行為并無明顯影響。

4 討論

樣品的前處理是血漿中藥物定量分析至關重要的一步。本課題組前期曾嘗試使用25%醋酸溶液和叔丁基甲醚或乙酸乙酯進行液液萃取，結果發現，此操作過程復雜且所需血漿量（500 μL）較大。與之相比，甲醇沉淀蛋白法操作過程簡便、快速;同時與已有的LC-MS/MS法比較[17]，本方法的血漿用量（50 μL）更少，更有利于樣品的批量采集。

在前期工作中，本課題組分別在正離子和負離子模式下對質譜參數進行了優化，發現在正離子模式下可獲得更寬的線性范圍和更強的色譜峰響應。同時，本課題組曾嘗試使用C8和C18兩種反相色譜柱進行分離，通過對流動相中有機相和水相的比例進行反復調試并結合內標物的篩選，最終確定使用色譜柱Agilent XDR-C18（2.18 mm×100 mm，1.8 μm），內標選擇地西泮，流動相甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）初始比例為40 ∶ 60（V/V）。方法學考察結果顯示，待測成分SP和內標的響應均較強，色譜峰峰形、峰強度和分辨率均較優;本方法的精密度、準確度均符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[15];提取方法、基質效應均不影響待測成分的定量分析。這提示本法可行、簡便、專屬性強。與現已報道的分光光度法[18]、LC-MS/MS法[17]和高效液相色譜法[9，19-20]相比，本法操作簡單、所需血漿量少，且具有更高的靈敏度和準確性。

SP是SSZ經腸道菌群分解所得的主要代謝物，約90%在結腸中被吸收入血。本文通過測定SSZ的代謝物SP在大鼠體內的血藥濃度，進一步研究ESOM對SSZ藥動學行為的影響。結果顯示，當聯合使用ESOM時，大鼠體內SP的藥動學參數cmax、AUC、t1/2z、MRT、CLz、Vz和tmax均無明顯變化。這不能排除可能與ESMO在大鼠體內作用時間較短、不足以使其腸道菌群發生改變有關。此外，有研究表明，長時間使用PPIs可導致腸道中厚壁菌門細菌增多[21];同時，除厚壁菌門中的葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬外，真桿菌屬、擬桿菌屬等多種細菌也已經被證實能夠產生偶氮還原酶[22]。因此，SSZ發生偶氮還原反應所需的酶不一定是由ESOM增多的菌株所產生。在研究過程中，筆者還發現，在給藥后的48～72 h內，兩組大鼠體內的SP的血藥濃度略有上述趨勢，這可能與部分未被吸收入血的SSZ隨膽汁轉移至腸道中并發生偶氮還原反應，生成SP被吸收入血有關[23]。

綜上所述，本研究成功建立了測定大鼠血漿中SSZ代謝產物SP濃度的LC-MS/MS法，該方法操作簡單、準確、靈敏、所需血漿量少，對SP的血藥濃度監測具有重要的參考價值。但本研究并未發現ESOM對SSZ藥動學行為有明顯影響。由于本研究ESOM的用藥時間有限，其是否足以導致大鼠腸道菌群發生改變等，都有待于后續研究進一步探討。

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（收稿日期：2021-02-22 修回日期：2021-05-17）

（編輯：張元媛）