基于微滴數字PCR技術建立HBV共價閉合環狀DNA的檢測方法

田 原, 徐 玲, 范子豪, 曹亞玲, 張向穎, 陳 煜, 段鐘平, 任 鋒

1 首都醫科大學附屬北京佑安醫院， 北京市肝病研究所， 北京 100069； 2 首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝病中心四科， 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069

HBV感染是影響全世界人民健康的主要公共衛生問題，有超過2.5億的HBV感染者，每年因HBV感染所導致的死亡人數大約有88.7萬[1-3]。目前，主要的抗病毒藥物如核苷(酸)類似物和干擾素α等都不能完全治愈HBV，根本原因在于不能徹底清除共價閉合環狀DNA(cccDNA)[4]。HBV cccDNA是病毒RNA復制轉錄的模板，它能以微染色體的形式長期穩定的存在于肝細胞核內[5]。因此，建立一種有效的檢測HBV cccDNA方法，對于臨床抗病毒治療效果的評價和治療策略的調整都具有重要意義[6]。本研究建立了檢測HBV cccDNA的微滴數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年6月—2020年10月在本院就診的20例臨床診斷為HBV感染者的肝組織樣本。質粒為本實驗室構建的pUC-HBV質粒。

1.2 試劑與儀器 QIAamp DNA Mini Kit(50)購自德國QIA-GEN公司；Plasmid-safe ATP-dependent DNase購自美國Lucigen公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix購自美國Applied Biosystems公司。新羿TD-1微滴式數字PCR儀購自新羿生物公司。ViiATM7 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 引物和探針的設計與合成 因為HBV cccDNA是完整的閉合環狀DNA，而HBV松弛環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)存在缺口，所以通過跨越HBV DNA負鏈缺口設計HBV cccDNA的上下游引物及探針(圖1)。引物及探針序列，HBV cccDNA-F：5′-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3′；HBV cccDNA-R：5′-AGGCACAGCTTGGAGGC-3′；HBV cccDNA-P：5′-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-3′。

圖1 HBV cccDNA與rcDNA結構示意圖

根據Gene Bank中提供的β-actin基因序列設計上下游引物和探針，并在PubMed上進行引物序列的比對。引物及探針序列：β-actin-F：5′-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3′；β-actin-R：5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′； β-actin-P：5′-FAM-CGGGAAATCGTGCGTGAC-TAMRA-3′。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 HBV cccDNA陽性對照質粒的建立 利用設計好的HBV cccDNA引物對HBV質粒擴增，然后純化回收目的片段，用目的片段與T載體連接，轉入JM109大腸桿菌中，再把大腸桿菌放入LB培養基中進行擴增，最后提取質粒。由此得到了HBV cccDNA陽性對照質粒。

1.5 肝組織HBV cccDNA模板的制備 先用QIAamp DNA Mini Kit提取患者肝組織DNA，然后用質粒安全性ATP依賴的DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase，PSAD)進行酶切，去除rcDNA等其他形式的DNA。PSAD酶切體系：肝組織DNA產物 8.5 μl、PSAD(10 U/L)0.4 μl、25 mmol/L ATP 0.8 μl、10×Buffer 2 μl，總體積為11.7 μl。反應條件：先在37 ℃水浴中放置12 h，然后在70 ℃水浴中放置30 min。終產物作為肝組織cccDNA的檢測模板。

1.6 ddPCR反應體系和條件 按照新羿生物公司提供的Probe dPCR SuperMix (with UNG)說明書配制反應體系為30 μl：2×SuperMix 15 μl、上游引物(10 μmol/L)0.6 μl、下游引物(10 μmol/L)0.6 μl、探針(10 μmol/L)0.6 μl、模板3 μl、ddH2O 10.2 μl。然后進行PCR反應，PCR反應條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環；12 ℃ 5 min。

1.7 熒光定量PCR反應體系和條件 利用設計的引物和探針建立熒光定量PCR檢測方法，配制反應體系為20 μl：TaqMan Fast Advanced Master Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、探針0.5 μl、模板2 μl、ddH2O 6.5 μl。擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，共30個循環。

1.8 標準曲線和檢出限分析 利用構建好的陽性對照質粒換算出拷貝數后進行梯度稀釋，稀釋的濃度分別為：1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝/μl。以稀釋后的產物為模板對該方法的準確度和靈敏度進行評價。根據陽性對照質粒的拷貝數和檢測結果的拷貝數計算出線性相關系數r2值。

1.9 重復性試驗 分別選取1×103、1×102、1×101拷貝/μl的陽性對照質粒為模板，進行3次ddPCR重復檢測，統計重復檢測結果，計算出變異系數。

1.10 兩種檢測方法對比試驗 提取20例患者肝組織DNA樣本，并利用PSAD酶切得到HBV cccDNA模板。對模板同時進行熒光定量PCR檢測和ddPCR檢測，檢測結果轉變為拷貝數進行對比。

1.11 倫理學審查 本研究方案經由首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會審批，批號：京佑科倫字(2020)132號。患者均簽署知情同意書。

1.12 統計學方法 所有數據采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線和檢出限分析 用梯度稀釋的陽性對照質粒繪制標準曲線(圖2)，用ddPCR檢出陽性對照質粒濃度的對數與其梯度稀釋濃度的對數作圖，線性方程為y=0.971 3x+0.318 5，r2值為0.989 6，具有較好的線性關系。表明ddPCR檢測HBV cccDNA的檢出限為1拷貝/μl，線性范圍為1×100～1×104拷貝/μl，見表1和圖3。

圖2 ddPCR標準曲線

圖3 梯度稀釋陽性質粒ddPCR微滴熒光分布

表1 梯度稀釋陽性質粒ddPCR檢測結果

經過對1×100拷貝/μl和陰性樣本多次重復檢測后，利用公式：LoB=μB+1.645σB (LoB為空白限，μB和σB為空白樣本檢測的均值和標準差)[7]，得到本研究方法的空白限為0.35 拷貝/μl。

2.2 重復性分析 選取濃度為1×103、1×102、1×101拷貝/μl的陽性對照質粒進行3次重復檢測，結果見表2。變異系數分別為4.41%、3.98%、5.09%，說明建立ddPCR檢測方法重復性較好，檢測結果可靠。

表2 重復性試驗結果分析

2.3 熒光定量PCR和ddPCR檢測方法對比 提取20例臨床HBV感染者的肝組織DNA樣本，進行PSAD酶切后得到HBV cccDNA模板。ddPCR方法能檢測出17例陽性樣本，陽性率為85%，而熒光定量PCR方法只能檢出11例，陽性率為55%，兩種方法比較差異有統計學意義(χ2=4.286，P=0.038)(表3)。

表3 熒光定量PCR和ddPCR檢測結果比較

3 討論

HBV cccDNA作為病毒復制和轉錄的模板，能夠長期穩定的存在于細胞核中。目前，用于治療HBV的藥物長期使用可有效降低肝內cccDNA的水平，但是不能完全清除[8-9]。因此研發靶向清除HBV cccDNA的藥物是治愈HBV的關鍵，同時也需要能夠精準檢測HBV cccDNA的方法，對治療效果做出及時的評價。由于HBV cccDNA在肝細胞內的拷貝數較低，每個細胞僅有5～50拷貝，所以就需要更加靈敏的檢測方法[10]。

現有的HBV cccDNA檢測方法主要是滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)、熒光定量PCR和巢式PCR等。科研人員利用RCA和熒光定量PCR結合的方法，檢測了石蠟包埋的肝組織切片中的HBV cccDNA，通過RCA有效提高了檢測的靈敏度，但是該方法步驟繁瑣，耗費時間較長[11]。Xu等[12]利用巢式實時熒光定量PCR的方法，對外周血單核細胞和骨髓單核細胞中的HBV cccDNA進行檢測，靈敏度達到了3.0×102拷貝/μl，并能準確檢測出臨床的陽性和陰性樣本。Guo等[13]開發了一種磁珠捕獲雜交的方法檢測血清中的HBV cccDNA，通過制備捕獲cccDNA的特異性納米粒子，從而有效區分rcDNA和cccDNA，提高了檢測的特異性，但是此方法需要特殊的材料，價格昂貴。

ddPCR是新一代的PCR技術，能對目標核酸進行絕對的定量分析而不依賴標準品和標準曲線[14]。ddPCR采用微滴式方法，將核酸溶液分散到微滴中，每個微滴不含或者含有一個至數個核酸模板數。經PCR擴增后，有核酸分子模板的微滴會出現熒光信號，沒有核酸分子模板的則無熒光信號。再根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例計算出目標核酸的原始拷貝數[14-16]。ddPCR相比于熒光定量PCR具有更高的靈敏度和特異度，已經被廣泛用于病原微生物檢測、基因多重定量檢測和罕見的生物變異檢測等許多領域[17-20]。

本研究建立了一種ddPCR檢測HBV cccDNA的方法，提高了檢出率，并具有較好的重復性。使用PSAD對樣本DNA進行處理，最大限度的降低單鏈DNA和線性雙鏈DNA對檢測的影響[21]。又通過對跨越HBV基因組負鏈的缺口區設計引物和探針，提高了HBV cccDNA擴增的特異性。對梯度稀釋后的HBV cccDNA陽性對照質粒進行檢測，發現ddPCR方法檢測陽性對照質粒的檢出限為1 拷貝/μl。把20例臨床肝組織DNA樣本經PSAD消化后的產物作為擴增的模板，用ddPCR方法和熒光定量PCR方法進行對比，結果顯示，ddPCR方法能準確檢出17例，陽性率為85%，而熒光定量PCR方法只能檢出11例，陽性率為55%，并具有統計學差異。表明ddPCR檢測方法優于于熒光定量PCR方法。

總之，本研究所建立的ddPCR檢測方法能夠準確、靈敏的對肝組織中的HBV cccDNA進行定量分析和檢測，提高了HBV cccDNA檢出率，對更好的評價HBV治療效果有較好的臨床應用價值。

利益沖突說明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：田原、徐玲負責資料分析，論文撰寫；范子豪、曹亞玲、張向穎負責收集和分析數據；陳煜、段鐘平、任鋒負責擬定寫作思路，指導撰寫并最后定稿。