人臍帶血單個核細胞聯合人臍帶間充質干細胞療法對乙型肝炎肝硬化患者肝功能、炎癥程度及免疫功能的影響

韓 霞， 云 升

內蒙古醫科大學附屬醫院 干細胞實驗室， 內蒙古醫科大學 干細胞研究中心， 呼和浩特 010050

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，引起肝硬化的病因有很多，歐美國家以酒精性肝硬化為主，而我國是以乙型肝炎引發的肝硬化為主，肝硬化患者的HBsAg陽性率高達76.7%[1]，其形成機制主要是由于肝炎病毒感染導致廣泛性肝細胞變性壞死、肝小葉結構破壞、肝臟彌漫性纖維化、結節性再生同時伴有假小葉形成，肝臟逐漸變形、變硬而發展為肝硬化。常選用保肝、降酶、退黃等基礎治療，而終末期肝硬化臨床治療效果差，缺乏廣泛可行的治療手段。干細胞移植的出現, 以其獨特的生物學特性，為肝病治療帶來新的治療思路。

臍帶血中造血干細胞含量豐富，其增殖能力是成人骨髓造血干細胞的數倍[2]，近年來國內外多項研究證實人臍帶血單個核細胞(human umbilical cord blood mononuclear cells, hUCB-MNCs)移植對肝硬化也有顯著的輔助治療效果[3]。

過去認為，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治療肝臟疾病趨向于受損的肝臟區域而后分化成肝細胞、修復受損肝細胞或通過免疫調節抑制炎性反應，促進肝功能恢復，但采集大量的骨髓多數患者很難接受，從而限制了臨床的廣泛應用。而人臍帶組織來源的間充質干細胞(human umbilical cord msenchymal stem cells, hUC-MSCs)，取材方便，較BMSCs有更高的增殖、分化潛能和免疫調節功能，其免疫原性遠低于BMSCs[4]，具有更加廣泛的臨床應用與研究價值[5]。為了提高肝硬化療效，本研究采用了hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs治療肝硬化，筆者前期臨床研究發現，hUCB-MNCs具有極其良好的提高患者免疫的功效[6]，因此先行輸注hUCB-MNCs，改善患者整體狀況，提高其免疫功能。而后輸入hUC-MSCs，使其歸巢到肝臟，分化為肝細胞或進入肝臟后修復受損的肝細胞[7-9]，并可通過某些細胞因子的改變, 來調節免疫、減輕炎癥反應、抗肝細胞凋亡、促進血管增生、抗肝纖維化等修復損傷肝組織，同時促進hUC-MSCs的多向分化[10-12]。兩種細胞聯合治療，以更好的發揮其療效。本研究為單中心、回顧性、非隨機、自體對照臨床研究。通過觀察聯合輸注治療肝硬化后各項指標的改變，對其治療肝硬化的免疫調節及安全性進行評價，為肝硬化的治療探索新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 臍帶血全部來源于山東省齊魯干細胞庫；臍帶采集于內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科，選取經剖宮產足月健康胎兒的臍帶，并征得父母授權同意，4 ℃預冷生理鹽水密閉容器保存。MSCs所用無血清培養基購自Invitrogen, USA、流式細胞分析儀所用單克隆抗體購自美國BD公司；ELISA試劑盒購自上海潤裕生物公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對象 選取2016年11月—2019年6月內蒙古醫科大學附屬醫院收治的失代償性肝硬化患者，納入標準：(1)診斷符合2000年中華醫學會肝病學分會修訂的《病毒性肝炎防治方案》[13]、2005 年中華醫學會肝病學分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的肝硬化臨床診斷標準[14]，診斷為乙型肝炎肝硬化，且Child-Pugh分級為B、C級(失代償期肝硬化)；(2)年齡40～60歲；(3)在加入本研究之前，理解并簽署知情同意書，并且遵守研究方案的要求；同意不參加其他任何臨床研究。排除標準：(1)除肝衰竭或肝硬化失代償以外的任何嚴重的全身性疾病，研究者認為可能會干擾受試者的治療或干擾受試者的依從性，包括任何未被控制的具有臨床意義的泌尿、循環、呼吸、神經、精神、消化、內分泌、免疫等系統疾病及腫瘤等；(2)肝靜脈或門靜脈血栓形成；(3)HIV抗體陽性者；(4)篩選前3個月內接受過其他藥物的臨床研究；(5)1年內有酗酒或有靜脈藥癮者；(6)HBV DNA>200 IU/ml；(7)腎衰竭，血肌酐>451 mol/L；(8)肺功能指標，FEV1<35%，DLCO-SB<39%；(9)根據AHA 1994年心功能標準D級；(10)其他可能妨礙臨床研究的嚴重情況。最終納入肝硬化患者11例，根據患者整體狀況進行Child-Pugh分級[15](表1)。入組的肝硬化患者經常規治療(保肝、降黃疸、降血氨、抗病毒、抗感染、必要時輸白蛋白等對癥支持處理，同時靜脈注射促肝細胞生長素80 mg/d)，治療4周后效果不佳(即肝功能、血氨、凝血因子、血清細胞因子濃度及淋巴細胞亞群的無變化，且神經、精神癥狀未改善者)，患者自愿申請參加本研究。

表1 入組患者的信息和條件

1.2.2 hUCB-MNCs制備 采集患者外周血，送山東省齊魯干細胞庫進行HLA血清和基因分型，選擇至少4個位點相合的臍帶血作為供者，然后將從臍帶血分離獲取的hUCB-MNCs(山東省齊魯干細胞庫操作制備)懸浮于含有2%人血白蛋白的0.9%生理鹽水(150 ml)備用。

1.2.3 hUC-MSCs制備 臍帶標本采集后至于4 ℃預冷生理鹽水密閉容器中，6 h內完成分離臍帶中華通氏膠，用MSCs無血清培養基培養制備hUC-MSCs，連續傳代培養，取P3代hUC-MSCs，應用流式細胞儀檢測細胞表面標記CD34、CD44 、CD90、CD105和HLA-DR的表達情況。臺盼藍染色活性檢測>95%，細胞HIV、EB病

毒、HBV、HCV核酸分別用PCR和逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測，檢測無任何微生物污染。最后制備的hUC-MSCs,用含有2%人血白蛋白的0.9%生理鹽水(150 ml)來懸細胞備用。

1.2.4 hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注方案 患者經常規治療后，臨床檢測肝腎功能、生化指標、腫瘤標志物、臨床評估心肺功能、神經、精神狀況達到入組標準。本研究方案為：第1周輸注1次hUCB-MNCs(>18×109/次)，第2、3、4周每周1次，每次輸入hUC-MSCs 1×106/kg，每個患者3次輸注的hUC-MSCs為同一來源的臍帶所分離培養。為了防止可能發生的過敏反應，輸注前5 min靜脈輸入5 mg地塞米松。hUCB-MNCs和hUC-MSCs回輸結束第4、8、12周后跟蹤隨訪。

1.2.5 hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注的不良反應、實驗室檢查及療效評估 一個治療方案結束后，有1例患者(No.5)腋下體溫38.1 ℃，持續時間為2 h，患者自行服用布洛芬，大量飲用溫開水發汗，排尿后體溫降到正常。在之后的隨訪過程中，所有患者均未出現明顯副作用；hUCB-MNCs和hUC-MSCs回輸結束第4、8、12周后采集靜脈血，檢測肝功能、血氨、凝血功能等各項指標，比較輸注前后及輸注不同時間后指標變化；同時對比觀察治療前后患者神經、精神狀況，根據患者整體狀況進行Child-Pugh肝功能分級。

1.2.6 細胞輸注后免疫細胞及細胞因子定量檢測 患者在細胞治療療程結束4周后開始檢測淋巴細胞亞群和血清細胞因子。流式細胞儀測定CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD4+CD25+調節性T淋巴細胞(Treg)、CD19+B淋巴細胞百分率；ELISA試劑盒量檢測血清IL-6、TNF、IL-10、TGFβ。

1.3 倫理學審查 本研究獲得內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，批號：2017醫第(028)號。所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 hUC-MSCs的鑒定 實驗室制備的hUC-MSCs呈貼壁生長，外形為均勻梭形(圖1)，流式細胞分析檢測，CD44、CD90和CD105表達均>98%(陽性)(圖2b、2c)，而CD34和HLA-DR表達為陰性(圖2d)；山東省齊魯干細胞庫提供的hUCB-MNCs總數>1.8×109；臺盼藍染色顯示活性>95%；血清學和基因HLA分型，供體與受體至少有4個位點相合(山東省齊魯干細胞庫提供)，無任何可檢測到的微生物污染，對山東臍血庫提供的細胞再次進行了流式細胞分析，檢測顯示其中CD34+細胞>1.5%(圖2e)；制備的hUC-MSCs可以被誘導成肝細胞、神經細胞(圖3)；常規和核酸PCR/RT-PCR檢測無任何微生物污染；裸鼠實驗證實無致瘤性； hUC-MSCs活性>95%。

2.2 hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs輸注前后及不同時間對肝功能、血氨及其他狀況的影響 在hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs輸注結束后，對PT和PTA影響最快，細胞輸注結束后第4周即可顯著改善(P值均<0.05)，而患者的肝功能酶學指標在細胞輸注后第8周逐漸恢復到正常水平(P值均<0.05)，在輸注結束第12周時，肝功能指標較之前明顯好轉(P值均<0.01)(表2)。

表2 細胞輸注前后肝功能變化

細胞輸注4周后，患者血清中血氨濃度明顯降低(P<0.05)，隨著時間的延長，血氨水平持續下降，除患者No. 7、10、11外，其他患者在hUCB-MNCs和HUC-MSCs輸注12周后均降低到正常水平(P值均<0.05)(表3)。

表3 hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs輸注前后血氨值變化

細胞輸注后第4、8周，5例肝硬化腹水患者的腹水均有所減少，除卻No.10患者仍有少量腹水，且Child-Pugh分級仍然處于C級。10例患者的乏力、食欲、睡眠、精神、腹脹、下肢水腫等明顯改善，血清膽紅素及PT基本恢復正常，血清Alb也明顯升高，Child-Pugh評分隨之降低，差異有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs輸注前后

注：a，陰性對照組；b，CD44和CD105表達為98.59%；c，CD44和CD90表達為99.06%；d，CD34和HLA-DR表達為0.08%；e，山東臍血庫CD34表達為1.66%。

注：a，hUC-MSCs分化誘導的肝細胞；b，hUC-MSCs分化誘導的神經細胞。

2.3 hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs輸注對血清細胞因子和淋巴細胞亞群的影響 采集患者靜脈血，ELISA定量檢測hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注前后血清炎性和抗炎細胞因子的含量，結果顯示輸注4周后患者血清炎性細胞因子IL-6、TNFα水平均明顯降低(P值均<0.01)，從8到12周，其血清中含量持續維持在正常水平；患者血清抗炎細胞因子IL-10、TGFβ在治療后4周顯著上升(P值均<0.01)，4周后基本恢復到正常值，到治療后的12周，其表達水平一直維持在正常值(表5)。

采用流式細胞儀分析淋巴細胞亞群比例，細胞輸注對CD3+T淋巴細胞無明顯影響，輸注4周后CD3+CD4+T淋巴細胞和CD4+CD25+Treg顯著升高(P值均<0.01)；而對CD3+CD8+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞具有較明顯的抑制作用，此狀態一直維持至12周 (表5) 。

表5 hUCB-MNCs聯合HUC-MSCs輸注前后細胞因子和淋巴細胞亞群變化

3 討論

我國HBV感染率高，最終導致肝硬化、肝功能失代償、門靜脈高壓、肝硬化，甚至肝癌等，死亡率呈逐年上升的趨勢。內蒙古地區是少數民族聚集地，人群感染HBV發生率更高[16]。加之內蒙古地區冬天比較寒冷和傳統習慣，多數男性喜歡飲酒，更加重了肝細胞的損傷，加速了肝硬化、門靜脈高壓以及肝癌的發生，因此很多患者在感染肝炎病毒后，發生肝硬化失代償的年齡相對較輕，大多數在60歲之前，而且以男性居多。

肝功能失代償并發肝硬化時，多數患者一般狀況較差，免疫功能低，易并發感染，特別是腸道感染，再加肝功能失代償年久，多數患者伴有腹水。所以應用干細胞治療此類患者前需要評估患者整體狀況，本臨床研究參與的患者，Child-Pugh分級多在B級和C級。

由于輸注細胞需要反復多次操作，而且肝硬化患者凝血功能差，為了盡量減少對患者的創傷，本研究未采用肝動脈介入注射技術，而是應用多次靜脈回輸的方法，更簡便、安全。

在輸注細胞前，除了對患者整體狀態進行評估外，還應用流式細胞檢測患者的免疫狀態。多數肝硬化患者的免疫功能普遍較低，特別是輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+)，明顯低于正常參考值，因此在hUC-MSCs治療前必須調整患者一般狀況，提高其免疫功能。筆者團隊前期臨床研究[6]發現，hUCB-MNCs具有良好的提高患者免疫的功效，本研究與患者及其家屬溝通，經患者本人及家屬同意，先輸注hUCB-MNCs，以便先改善患者整體狀況，提高其免疫功能。臨床觀察發現部分患者在輸注hUCB-MNCs后，甚至在1周之內，全身不適、食欲、精神狀況明顯改善，流式細胞分析靜脈血中輔助性T淋巴細胞有所上升，此效果與筆者團隊前期研究[6]結果相同，說明hUCB-MNCs也可以改善肝硬化患者的一般狀況和免疫功能。

研究提示hUC-MSCs能夠向多方向分化，如神經、骨骼、肌肉、心肌、肝細胞等[17]，同時具有強大的修復功能[18]。已知肝細胞感染HBV感染后，肝細胞損傷、壞死，釋放大量的肝細胞酶，經常規治療后門靜脈壓降低，腹水形成也相應減少，但是胃腸道的有毒物質未經肝臟處理，直接進入體循環，部分患者血氨明顯升高。而hUC-MSCs輸入后，可以歸巢到肝臟，分化為肝細胞或進入肝臟后修復受損的肝細胞，血液內的有毒物質可以被代謝并排除體外，從而起到治療肝硬化的作用，本研究結果證實，hUCB-MNCs和hUC-MSCs聯合輸入4周后，部分患者的血氨下降，肝硬化癥狀逐步得以控制；除此之外，hUC-MSCs還可以分化為神經細胞，同時具有強大的修復神經細胞損傷的功能[19-20]，所以hUC-MSCs輸入后肝硬化患者精神、神經狀態不佳的情況相應減輕，筆者推斷可能與此也有一定的關系，有待進一步驗證。

由于肝細胞受損，靜脈血中肝細胞酶類升高、膽紅素釋放增加、合成Alb功能降低，輸注hUC-MSCs歸巢到肝臟，受微環境的影響分化為肝細胞，同時發揮hUC-MSCs的修復功能，使損傷的肝細胞得以恢復，酶釋放減少，凝血酶原和Alb合成增加，腹水減輕，患者的一般臨床癥狀改善, Child-Pugh評分隨之降低,而Child-Pugh評分又可預測失代償期肝硬化患者的短期預后，對選擇適當的臨床治療方案有一定指導作用[21]。研究發現細胞治療對于門靜脈高壓導致的腹水療效較差，如本研究的No.10患者腹水減輕并不明顯。

眾所周知，HBV感染后，肝細胞及其周圍組織同時發生持續和反復慢性炎癥反應，由于參與炎性反應的細胞主要是CD3+CD8+T淋巴細胞和產生抗體的CD19+B淋巴細胞，此類細胞在肝內的聚集，釋放大量的炎性細胞因子，刺激肝內纖維細胞過度增生，導致肝硬化，同時釋放的炎性細胞因子和抗體也可以進一步殺傷和破壞肝細胞。已知hUC-MSCs本身及其釋放的外泌體具有強大的免疫調節功能[22-23]，可以抑制過度活躍、聚集于肝內的炎性細胞。本研究中心經長期的臨床試驗發現，hUC-MSCs輸注后，隨著時間的延長，炎性細胞及其炎性因子，如IL-6、TNFα逐漸降低[24]。而CD4+CD25+Treg逐漸上升，說明輸注hUC-MSCs可上調肝硬化患者CD4+CD25+Treg水平，這一結果與文獻研究結果[25-26]相吻合；抗炎細胞因子IL-10、TGFβ逐漸上升，抑制了炎性反應的進一步加重，防止肝細胞持續損傷、壞死，同時間接地調控肝組織的進一步纖維化[24]。

提示hUCB-MNCs聯合hUC-MSCs治療可通過影響機體的免疫狀況來調節免疫性疾病的轉歸，可能產生的副作用目前還在隨訪觀察中。截至目前，11例入組治療患者均未發現明顯的不良反應。這些研究結果為hUCB-MNCs和hUC-MSCs聯合療法可以優化肝功能且抑制病情發展提供了有力的依據。

hUCB-MNCs和 hUC-MSCs聯合輸注可以分化為肝細胞或進入肝臟后修復受損的肝細胞，抑制炎性因子釋放，上調Treg水平，從而調節肝硬化患者免疫功能，改善患者一般狀態。針對檢測指標的改變，對其治療肝硬化的免疫調節機制進行評價，為終末期肝病的治療探索新方法。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：韓霞負責申報課題，資料分析，撰寫論文；云升負責課題設計，擬定寫作思路，修改文章并最后定稿。