基于網絡藥理學探析5種經典方劑治療肝細胞癌的作用機制

程秋駱， 劉 柳， 白長川， 叢慶偉， 朱 英

1 大連醫科大學附屬第一醫院 中西醫結合肝病中心， 遼寧 大連 116011; 2 大連醫科大學 中西醫結合學院，遼寧 大連 116044； 3 大連市中醫醫院 中醫科, 遼寧 大連 116013

肝癌是世界主要高發癌癥，70%～90%的病理類型為肝細胞癌(HCC)[1]，是癌癥導致死亡的第二大常見原因[2]。大多數HCC患者在臨床Ⅲ或Ⅳ期才被診斷，而中晚期肝癌除索拉非尼、免疫檢測點治療以及經動脈化療栓塞外的可用治療手段非常稀少[3-5]。目前，HCC患者中位總生存期為9個月，5年生存率約為10%[6]。

為了尋找新的治療方案以及改善患者生活質量，中醫藥在癌癥中的運用越來越得到重視。中醫藥具有多組分、多靶點和協同作用的特征[7]。網絡藥理學是將中醫藥和現代醫學結合起來的一個重要橋梁,從整體角度揭示藥物作用機制，具有完整性、協同作用和動態特征，將單一靶點，單一藥物轉變為多靶點，多組分模式[8]，與中醫整體理論相吻合[9]。

中醫認為肝癌屬于“肥氣、痞氣、積氣、肝積、鼓脹、黃疸”范疇，多由于臟腑氣血耗傷，情志內傷，脾虛濕盛，痰濕結聚，使全身氣機失調，邪毒由表入里，氣、血、濕、熱、痰、瘀互結而成。《原發性肝癌診療規范(2019年版)》[10]中將肝癌分為五大證型:肝郁脾虛、肝膽濕熱、肝熱血瘀、脾虛濕困、肝腎陰虛。其代表方劑分別為逍遙散合四君子湯(出自《太平惠民和劑局方》)、茵陳蒿湯(出自《傷寒論》)、龍膽瀉肝湯(出自《醫方集解》)、下瘀血湯(出自《金匱要略》)、五皮飲(出自《證治準繩》)、一貫煎(出自《續名醫類案》)。基于此，本研究擬對5種方劑進行網絡藥理及分子對接篩選出相應的活性成分以及活性靶點。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分篩選及藥物靶點預測 匯總5種方劑中各單味藥的標準中藥名稱在TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、TCMID (http://www.megabionet.org/tcmid)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、TCM-MESH(http://mesh.tcm.microbioinformatics.org)數據庫以及相關研究文獻搜索出的全部化學成分，根據藥代動力學參數：口服生物利用度≥30%和類藥性指數≥0.18篩選出符合條件的候選活性成分。以活性成分全稱為檢索詞在Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中檢索其Carcinoma Smiles號，然后將其導入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫對活性成分靶點進行預測。

1.2 肝癌疾病靶點預測 以“Liver cancer” 為關鍵詞在TTD(https://db.idrblab.org/ttd)、Drugbank(https://www.drugbank.ca)、Disgenet(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、Liverome(http://liverome.kobic.re.kr/index.php)、OncoDB.HCC(http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm)數據庫檢索，在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫篩選出同時含有肝癌組織和正常組織的人源基因芯片，文件編號：GSE121248、GSE58208，使用GEO2R在線分析，以adj.P.Val<0.05 為條件，篩選出肝癌組織與正常組織的差異基因。

1.3 構建“活性成分-作用靶點”網絡 通過Venny繪圖軟件，將肝癌疾病靶點與活性成分靶點進行映射，從而獲得5種辨證方劑治療肝癌的潛在作用靶點。將5種方劑的活性成分以及其治療肝癌的潛在作用靶點分別導入Cytoscape3.7.1軟件中，節點代表5種方劑中活性成分以及治療肝癌潛在靶點；邊展現了5種方劑活性成分與作用靶點之間的聯系。運用Cytoscape軟件中 “Network Analyzer” 功能對5種方劑的活性成分-作用靶點網絡分別進行分析，選取連接度較高的活性成分作為關鍵活性成分，根據連接度調節網絡中的相應節點大小、顏色的深淺和排序。

1.4 PPI網絡構建及Hub基因篩選 為了明確5種方劑中成分預測靶點與肝癌作用靶點之間的相互作用，將映射后的共同靶基因上傳至STRING在線網絡平臺(https://string-db.org/)，設置蛋白種類為“人”，設置置信度>0.9，從而獲得蛋白互作關系，將結果導入Cytoscape 3.7.1軟件中，并使用軟件中“Cytohubber”的“Degree”功能篩選出度值排名前5的Hub基因。

1.5 Hub基因生存分析 將篩選出的Hub基因在GEPIA在線網站(http://gepia.cancer-pku.cn/)上進行生存分析，得出結果P<0.05則提示該基因為肝癌的預后靶點，提示該基因與患者預后的關系。

1.6 核心活性成分與Hub基因分子對接驗證 在Pubchem搜索核心活性成分，下載其3D分子結構，保存為sdf格式，再從PDB數據庫下載關鍵蛋白的3D晶體結構，保存為PDB格式。將活性成分及關鍵蛋白的結構文件導入DockThor (https://dockthor.lncc.br/v2/)網站進行分子對接，從而驗證網絡藥理學篩選結果，分子對接結合能越小表示蛋白和配體兩者之間具有較好的結合活性。

1.7 GO生物學功能富集和KEGG基因通路分析 將治療肝癌潛在基因信息導入DAVID數據庫，然后選擇生物學過程、分子功能、細胞組成、KEGG信號通路進行GO生物學功能富集分析以及KEGG通路分析，將與本疾病無關通路刪除，選取P<0.05的前15條生物學過程以及前10條通路。

2 結果

2.1 5種經典方劑活性成分及靶點篩選結果 逍遙散合四君子湯活性成分共計110(單位：個，以下均如此)，其中柴胡17，白芍8，當歸2，薄荷9，生姜4，甘草66，茯苓9，白術2，人參5，活性成分靶點共計7426。茵陳蒿湯活性成分共計19，其中茵陳8，梔子5，大黃8，活性成分靶點共計1435。龍膽瀉肝湯合下瘀血湯活性成分共計154，其中柴胡17，梔子5，桃仁12，大黃8，當歸2，甘草66，木通5，澤瀉6，車前子6，黃芩19，龍膽草8，土鱉蟲4，生地黃6，活性成分靶點共計9544。五皮飲合四君子湯活性成分共計121，其中人參5，白術2，茯苓9，甘草66，陳皮5，桑白皮17，大腹皮1，茯苓皮3，生姜皮17，活性成分靶點共計6619。一貫煎活性成分共計51，其中北沙參13，枸杞31，川楝子9，當歸6，生地黃6，麥冬3，活性成分靶點共計2427。

GEO數據庫篩選出肝癌組織與正常組織的差異基因3422個，其他數據庫篩選出655個肝癌疾病靶點，去除重復后篩選出肝癌疾病靶點共計4001個。5種經典方劑的成分靶點與肝癌疾病靶點的交集靶點分別為260、169、276、242、192個(圖1)。

2.2 “活性成分-作用靶點”網絡可視化分析 利用Cytoscape軟件進行網絡可視化是網絡藥理學分析的關鍵部分，選取平均自由度到最大自由度之間的節點構建“活性成分-作用靶點”網絡，如附錄1所示，圖中圓形節點代表活性成分，菱形節點代表交集靶點，各個節點的大小代表Degree值的大小，各個節點的透明度根據Degree值的大小從低到高排列。如表1所示，前4種方劑取自由度>40的節點，一貫煎取自由度前5的節點，逍遙散合四君子湯各活性成分度值中位數為30，茵陳蒿湯各活性成分度值中位數為36, 龍膽瀉肝湯合下瘀血湯各活性成分度值中位數為35,五皮飲合四君子湯各活性成分度值中位數為28，一貫煎中各活性成分度值中位數為18，總結后發現槲皮素是5種經典方劑的共同成分且對應度值大于其對應方劑中活性成分自由度中位數，異補骨脂黃酮和Kanzonol W是逍遙散合四君子湯、龍膽瀉肝湯合下瘀血湯以及五皮飲合四君子湯的共同成分且度值大于其對應方劑中活性成分自由度中位數。

表1 5種經典方劑度值靠前成分及其MOLID編號

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

2.3 PPI網絡及Hub基因篩選結果 通過PPI網絡篩選出5種經典方劑治療肝癌潛在的5個Hub基因，如附錄2所示，綠色靶點分別代表5種經典方劑治療肝癌潛在作用靶點，右側5個靶點根據度值大小依次由深到淺從上向下排列。度值排名前5的基因分別為PIK3CA、SRC、AKT1、MAPK1、MAPK3，每個靶點具體度值見表2。

表2 5種經典方劑PPI網絡中Hub基因度值

2.4 生存分析結果 通過GEPIA數據庫的分析，由于AKT1的最終結果P>0.05，所以暫不將其視為肝癌的預后靶點，剩余4個靶點P值均<0.05，可視為肝癌預后靶點，降低其表達可改善患者的生存預后。另外，本課題組前期實驗研究[11]發現LOXL2也是肝癌的調控靶點，且為SRC的上游基因，所以將LOXL2也加入其中，分析結果如圖2所示。

圖2 5個靶蛋白基因表達與肝癌預后關系

2.5 分子對接結果 5種經典方劑治療肝癌的共同成分為槲皮素，其中3種方劑的共同成分為異補骨脂黃酮和Kanzonols W。其治療肝癌潛在的Hub基因5個，其中有4個可暫定為肝癌預后靶點，加上LOXL2基因，共計5個靶蛋白與3種活性成分進行分子對接，如表3所示。圖3顯示Kanzonols W與SRC的結合能力最強，其次為槲皮素和異補骨脂黃酮。從總體趨勢來看3種成分與PIK3CA、SRC、LOXL2結合能力相對較好。

表3 5種經典方劑關鍵活性成分與關鍵基因的分子對接結果

圖3 5種方劑關鍵活性成分與關鍵靶點分子對接評分統計圖

2.6 Hub基因參與的生物學功能及通路富集分析 5種經典方劑治療肝癌的潛在靶點進行GO富集和KEGG通路分析結果如下：逍遙散合四君子湯GO結果806(單位：條，以下均如此)，KEGG通路113；茵陳蒿湯GO結果554，KEGG通路106；龍膽瀉肝湯合下瘀血湯GO結果826，KEGG通路120；五皮飲合四君子湯GO結果806，KEGG通路112；一貫煎GO結果720，KEGG通路109。對各結果的P值進行排序后選取GO結果前10條進行柱狀圖展示，包括生物進程、細胞組成以及分子功能，如圖4所示。KEGG通路選取前15條進行氣泡圖展示如圖5所示。深入分析5種方劑的結果，發現其共同參與的生物學過程是對藥物的反應、蛋白質磷酸化、炎癥反應、血管生成；細胞組成是胞質溶膠、細胞器、細胞質、蛋白質復合物；分子功能是蛋白激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結合、蛋白質結合。共同調控的KEGG通路為癌癥通路、PI3K-AKT通路、MAPK通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路。

3 討論

終末期肝癌在臨床較為常見，經循證醫學研究[12-15]發現該階段中醫證型多以血瘀證和肝腎陰虛證為主，所以本研究也從血瘀證和肝腎陰虛證為重點研究對象，對“活性成分-作用靶點”網絡拓撲結構經行分析后發現槲皮素為5種方劑的共同活性成分，度值均大于節點的中位數，異補骨脂黃酮和Kanzonol W為肝郁脾虛、肝熱血瘀、脾虛濕困代表方劑的共同有效成分且度值大于節點中位數，最終選擇槲皮素、異補骨脂黃酮和Kanzonol W為重點研究成分。

槲皮素和異補骨脂黃酮屬于常見的天然黃酮類化合物，兩者均具有良好的抗腫瘤作用。其中槲皮素的生物學效應包括抗氧化、抗炎、抗增殖、抗血管生成的作用，也有著抗腫瘤的作用，其抗腫瘤作用機制包括調節PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK1/2途徑來促使細胞活力喪失，促使細胞自噬能力以及誘導細胞凋亡[16-19]。槲皮素在體內外實驗[20]中表明其有著良好的抑制HepG2肝癌細胞增殖以及促進其凋亡的作用。異補骨脂黃酮在抗腫瘤及免疫調節具有良好的作用且可以直接抑制SRC激酶的活性[21]，且有實驗研究[22]證實異補骨脂黃酮有抑制HepG2細胞增殖的作用。Kanzonol W是甘草的活性成分，有研究[23]證實該成分對HepG2細胞的增殖有抑制作用，但由于其提取工藝較為復雜，其研究實行相對困難。

本課題組前期研究[11]的重點基因LOXL2能促進肝癌細胞的侵襲、轉移，對肝癌的發生發展有著較為重要的作用，所以將該基因納入研究中。PIK3CA、SRC、MAPK1、MAPK3、LOXL2與肝癌預后不良有關，其高表達與肝癌患者的總體生存不良有關。將上述5個基因與槲皮素、異補骨脂黃酮、Kanzonol W分子對接總體趨勢提示3種成分與PIK3CA、SRC、LOXL2結合能力相對較好。并且搜索5個靶蛋白相關文獻后發現均與肝癌有相關性，從而提示該研究方法是科學可行的。

非受體酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src, Src)，其編碼的蛋白歸屬于Src家族激酶(SFKs)，研究[24]證實，人類SRC的基因產物C-Src通過調節腫瘤細胞的凋亡、增殖、侵襲、遷移與耐藥性參與了腫瘤的惡性發展并促進了癌癥的發生進展。賴氨酰氧化酶樣2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)通過使FAK/SRC信號通路活化而介導上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[25]，表明LOXL2在上皮細胞可塑性方面有著非常規的作用，通過EMT上皮細胞將獲得較高的遷移與侵襲及抗凋亡作用，從而在惡性腫瘤的發生發展轉移的病理過程發揮著至關重要的作用。就LOXL2基因而言，已經有研究證實其與HCC的不良預后具有相關性，其具體機制可能是通過該基因的過度表達從而增加SNAIL的表達，最終促使血管生成擬態形成和腫瘤的轉移，而血管生成擬態是已知肝癌發生的3種微循環模式其中之一，是腫瘤微環境中血管生成的一種新形式，一般惡性程度較高且容易轉移[26]。C-Src與受體激酶發揮協同作用，從而傳導下游如PI3K/PTEN/Akt最終起到調節增殖、侵襲、轉移和血管生成的作用。磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3激酶催化亞基α亞型(Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, PIK3CA)隸屬于PI3K/AKT/mTOR通路，研究[27]證實該通路是肝癌發生的有效誘導因子且PIK3CA基因具有多態性，基因之間單獨或協同作用可以增加肝癌發生的風險。因此，PIK3CA是SRC的下游因子，LOXL2通過激活FAK/SRC通路而介導EMT，3個基因之間存在一定的聯系且都被證實與肝癌的發生發展具有相關性。此外，對5種經典方劑治療肝癌的潛在基因KEGG富集分析可知代謝通路主要發生在PI3K-AKT、MAPK、Ras、HIF-1通路，這些通路與肝癌的發生及治療密切相關，這些潛在基因還參與了乙型肝炎、丙型肝炎以及癌癥通路。

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

綜上所述，本文以5種經典方劑治療肝癌的潛在作用靶點為對象，利用網絡藥理學技術分析了其關鍵活性成分、關鍵靶點及信號通路，并聯合分子對接技術驗證了相關成分與肝癌靶點的相互作用關系。初步揭示了槲皮素、異補骨脂黃酮、Kanzonl W可能涉及到多靶點、多通路、多過程協同的抗肝癌特點，為后續深入研究其抗肝癌作用機制提供了參考方向。

利益沖突聲明：本文不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：程秋駱負責文章撰寫，文獻查找與整理，并撰寫初稿；劉柳、叢慶偉參與文章網絡藥理學部分數據查找并檢索相關文獻；白長川負責中醫思路部分指導；朱英負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1～2見二維碼