基于流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法

寧 曼，徐 崢，何義亮

(上海交通大學(xué)中英國際低碳學(xué)院，上海 200240)

超微藻是水體中藻種群結(jié)構(gòu)的重要組成部分，由于其獨(dú)特的生長特性和豐富的物種組成，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為水體中微生物構(gòu)成的研究熱點(diǎn)。超微藻在數(shù)量上雖不如傳統(tǒng)的非超微藻[1]，但其對水體初級生產(chǎn)力和群落結(jié)構(gòu)多樣性及穩(wěn)定性等方面貢獻(xiàn)巨大，深入了解超微藻的動態(tài)變化規(guī)律有利于更好的評估水體水質(zhì)質(zhì)量。

目前的研究中，對超微藻進(jìn)行檢測的手段很少，且具有局限性。光學(xué)顯微鏡受到放大倍數(shù)和分辨率的限制[2]，無法滿足細(xì)胞計(jì)數(shù)和種群識別的要求，具有耗時(shí)長、人為誤差明顯的缺點(diǎn)。而熒光顯微鏡對自發(fā)熒光較弱且混合生長的藻群辨認(rèn)準(zhǔn)確率低，不能反映藻細(xì)胞的生理狀況。平板計(jì)數(shù)法耗時(shí)長，操作過程中對無菌環(huán)境條件要求極嚴(yán)格，且因超微藻大部分種屬不能直接進(jìn)行分離純培養(yǎng)而無法運(yùn)用[3]。

針對以上難點(diǎn)，流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)的運(yùn)用為超微藻總量測定和種群識別提供了新方向。流式細(xì)胞儀能對超微藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和熒光檢測，得到藻細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)色素含量及與純培養(yǎng)藻細(xì)胞位置的對照完成藻群識別，但一般只能精確到門級別，需要分子生物學(xué)手段的輔助從而獲得更加準(zhǔn)確的種屬信息。高通量測序技術(shù)作為分子生物學(xué)技術(shù)的一個(gè)重要分支[4]，明確不同微生物的注釋信息和相對豐度變化信息，有助于對微生物多樣性及其分布模式進(jìn)行更深入的探究，但針對超微藍(lán)藻和超微真核藻的高通量測序方法還有待進(jìn)一步研究和優(yōu)化。在測序微生物的收集方法上，傳統(tǒng)的水樣過濾方法在很大程度上造成了對環(huán)境中超微藻多樣性的低估[5-6]，流式細(xì)胞儀的分選功能可有效去除水體中大部分不能自發(fā)熒光的細(xì)菌、真菌等[7]，減少異樣模版的競爭，提高超微藻序列在整個(gè)克隆庫中的比例，解決了對超微藻細(xì)胞進(jìn)行有效收集和保存的難題。近年來，已有研究嘗試使用流式細(xì)胞儀分選功能進(jìn)行真核藻類的分選[1]，但研究范圍較局限。

本研究針對超微藻檢測進(jìn)行方法體系的構(gòu)建和優(yōu)化調(diào)整，在前人的基礎(chǔ)上將流式細(xì)胞技術(shù)和高通量測序技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，改進(jìn)技術(shù)流程和參數(shù)，流式細(xì)胞儀對超微藻的分選功能可以彌補(bǔ)高通量測序技術(shù)異養(yǎng)細(xì)菌干擾的缺點(diǎn)，而高通量測序技術(shù)鑒定精確到種級別的優(yōu)點(diǎn)可以彌補(bǔ)流式細(xì)胞儀對超微藻識別不精確的問題。通過細(xì)胞大小和熒光分析對藻群變化初步認(rèn)識，再利用流式細(xì)胞儀分選目標(biāo)藻群，隨后進(jìn)行高通量測序，更好地揭示超微藻的結(jié)構(gòu)特征和生物多樣性。本研究提出綜合運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)和高通量測序技術(shù)進(jìn)行方法的互補(bǔ)融合和多功能聯(lián)動，是非常重要而基礎(chǔ)的方法改進(jìn)。

1 方法的構(gòu)建

1.1 整體流程的提出

綜合運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)和高通量測序技術(shù)對超微藻進(jìn)行檢測，方法構(gòu)建流程如圖1所示。通過流式細(xì)胞儀的分析、分選功能和高通量測序技術(shù)的聯(lián)用，獲得超微藻的數(shù)量和種屬信息，對特定采樣周期的樣本進(jìn)行分析，獲得超微藻構(gòu)成的動態(tài)變化特征。

圖1 方法構(gòu)建流程Fig.1 Flow Chart for Method Construction

1.2 流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置及調(diào)整

1.2.1 溶液配制

鞘液的配制：準(zhǔn)確稱量NaCl(80 g)、KCl(2 g)、Na2HPO4·12H2O(35.8 g)、KH2PO4(2.4 g)，加入盛有1 L ddH2O的燒杯中，攪拌均勻，待完全溶解后通過0.22 μm微孔濾膜過濾，添加ddH2O至10 L，溶液置于桶中用高壓滅菌鍋進(jìn)行121 ℃滅菌15 min，待鞘液冷卻至常溫后倒入分選儀器加液桶備用。

熒光微球(FluoSpheresTMcarboxylate，2 μm，yellow-green 505/515)原始濃度為4.65×109particles/mL，嚴(yán)格避光貯存于2～4 ℃冰箱中，吸取前使用超聲波清洗機(jī)超聲10 min，防止帶磁性的微球吸附在管壁上，斡旋機(jī)高速振蕩3 min，使微球混合均勻。配制中間液時(shí)，加入蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋，使熒光微球在水樣中的最終濃度與藻細(xì)胞濃度相近，本試驗(yàn)熒光微球最終濃度為4.65×104particles/mL。中間液需現(xiàn)配現(xiàn)用，置于5 mL鎖扣蓋式無菌BD Falcon流式管中。

1.2.2 參數(shù)設(shè)置及調(diào)整方法

采用流式細(xì)胞儀(beckman coulter，BD)對樣本中的藻細(xì)胞進(jìn)行分析，儀器配備水冷氬離子激光器，選用的激發(fā)波長為488 nm和633 nm。由于藻細(xì)胞含有葉綠素和藻膽素等天然色素，可自發(fā)熒光無需染色，根據(jù)光合色素的光學(xué)特征，設(shè)置5個(gè)熒光通道：前向散射光(FSC，488/10)表征細(xì)胞大小；側(cè)向散射光(SSC，488/10)表征細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度；PE，585/42表征藻紅蛋白的含量；APC，780/60表征藻藍(lán)蛋白的含量；PC5.5，690/50表征葉綠素a的含量[9]。水樣通過40 μm的濾網(wǎng)過濾，防止阻塞儀器。進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證熒光通道的有效性并對儀器參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，主要分為以下3個(gè)步驟：作為空白對照，1 mL無菌ddH2O置于5 mL無菌流式管中進(jìn)行上樣，調(diào)整各通道閾值，使無熒光黑團(tuán)消失，去除水中雜質(zhì)、破碎細(xì)胞及無關(guān)細(xì)菌的干擾；1 mL適當(dāng)濃度的熒光微球置于5 mL無菌流式管中進(jìn)行上樣，調(diào)節(jié)各通道電壓值，使熒光微球聚集且成像清晰，若出現(xiàn)熒光微球分散的情況，重新配制中間液，并保證溶液混合均勻，與步驟一空白對照組進(jìn)行比較，去除雜質(zhì)，調(diào)節(jié)前如圖2(a)所示，調(diào)節(jié)后如圖2(b)所示；1 mL過濾后的實(shí)際水體樣本置于5 mL無菌流式管中，微調(diào)電壓值使細(xì)胞全部成像于二維散點(diǎn)圖中，調(diào)節(jié)進(jìn)樣速度，使每秒細(xì)胞數(shù)在100～1 000個(gè)。正式上機(jī)時(shí)，1 mL過濾后的實(shí)際水體樣本與熒光微球混合上樣，流速設(shè)置為中等流速30 mL/min，待進(jìn)樣穩(wěn)定后點(diǎn)擊record，每個(gè)樣品運(yùn)行3 min，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

圖2 熒光微球調(diào)節(jié)示意圖 (a)調(diào)整前；(b)調(diào)整后Fig.2 Adjustment of Fluorescent Beads (a) before Adjustment； (b) after Adjustment

1.3 超微藻的濃度測定及分選方法

在二維散點(diǎn)圖中將熒光通道兩兩組合，含有相似色素或熒光特征的藻細(xì)胞聚集在一起，根據(jù)藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a熒光強(qiáng)度的相對強(qiáng)弱進(jìn)行藻群的區(qū)分，并與純培養(yǎng)細(xì)胞的相對位置進(jìn)行比對。記錄事件數(shù)events，藻細(xì)胞的濃度計(jì)算方法如式(1)。

(1)

在運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行超微藻的分選時(shí)，水樣預(yù)先通過40 μm的濾網(wǎng)過濾，防止阻塞儀器。過濾后每3 mL樣品放于5 mL鎖扣蓋式無菌BD Falcon流式管中用于上機(jī)分選操作，采用流式細(xì)胞儀(FACSAria IIr，BD)對樣品中的全部超微藻細(xì)胞(包括超微真核藻和超微原核藻)進(jìn)行分選，溶液配制同1.2.1所述，激光波長、熒光通道同1.2.2所述。觀察分選通道中細(xì)胞通過狀態(tài)及偏移程度，檢驗(yàn)進(jìn)樣口和收集口是否處于無菌環(huán)境，預(yù)試驗(yàn)以無菌ddH2O為空白對照去除細(xì)菌等雜質(zhì)的干擾，根據(jù)熒光微球在FSC軸的位置劃定分選區(qū)域，選用1.5倍鏡，調(diào)節(jié)熒光通道閾值和電壓值使分選區(qū)域位于散點(diǎn)圖中央，如圖3所示。正式分選試驗(yàn)時(shí)，保證進(jìn)樣口和取樣口處于無菌環(huán)境，開啟樣本攪拌功能，設(shè)置分選模式為Purity-Mode1，分選速度設(shè)定為2.0～4.0，每秒細(xì)胞數(shù)在1 000個(gè)左右。收集分選細(xì)胞的流式管中加入1 mL無菌PBS緩沖液和細(xì)胞溶解液，每個(gè)樣品分選約35 000個(gè)細(xì)胞，在基因組DNA提取及23S rDNA高通量測序操作前置于-80 ℃冰柜。

圖3 超微藻分選區(qū)域Fig.3 Sorting Area of Picophytoplankton Cells

1.4 高通量測序方法

目前，應(yīng)用于超微藻多樣性研究的靶基因序列主要包括16S rDNA、18S rDNA、功能基因rbcL等[5]，沉降系數(shù)和引物選取的不同，呈現(xiàn)出特定的測序結(jié)果和方向，高通量測序方法及參數(shù)的選取對測序結(jié)果具有重要影響作用。用于藻類檢測傳統(tǒng)的方法是16S rDNA測序，對藍(lán)藻檢測效果良好，但無法對真核藻類的種屬信息和相對豐度進(jìn)行全面認(rèn)識。為了獲得超微藍(lán)藻和超微真核藻的序列信息，本研究采用23S rDNA高通量測序方法，方法如下所述，并與傳統(tǒng)16S rDNA高通量測序方法進(jìn)行補(bǔ)充和對比，方法參照文獻(xiàn)[10]。

購買E.Z.N.A Water DNA提取試劑盒(OMEGA，美國)進(jìn)行基因組DNA的提取，用于目的片段PCR擴(kuò)增。隨機(jī)選取樣品進(jìn)行PCR預(yù)試驗(yàn)，調(diào)整參數(shù)并評估擴(kuò)增效果，最終確定正式試驗(yàn)程序，所采用的PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型，選用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反應(yīng)體系，包括4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mM dNTPs、0.8 μL Forward Primer(5 μM)、0.8 μL Reverse Primer(5 μM)、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA。擴(kuò)增引物選定雙前向引物(A23SrVF1：GGACARAAAGACCCTATG, A23SrVF2：CARAAAGACCCTATGMAGCT)和雙逆向引物(A23SrVR1：AGATCAGCCTGTTATCC, A23SrVR2：TCAGCCTGTTATCCCTAG)[11]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序參數(shù)：a.1× (3 min, 95 ℃)；b.循環(huán)數(shù)×(95 ℃，30 s；退火溫度：55℃，30 s；72 ℃，45 s)；c.72 ℃，10 min，保持10 ℃直到反應(yīng)結(jié)束。一輪擴(kuò)增引物A23SrV1F_A23SrV1R，退火溫度為55 ℃，循環(huán)次數(shù)為25；二輪擴(kuò)增引物A23SrV2F_A23SrV2R，退火溫度為55 ℃，循環(huán)次數(shù)為30。在進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與回收時(shí)，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，對電泳后的目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收和定量檢測。本試驗(yàn)所有樣本PCR質(zhì)檢報(bào)告等級達(dá)到B等級以上，Illumina MiSeq平臺雙端測序的原始數(shù)據(jù)和結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

流式細(xì)胞儀分析的原始數(shù)據(jù)以FCS格式儲存，藻細(xì)胞的計(jì)數(shù)和熒光分析通過CytoFLEX軟件完成，根據(jù)色素?zé)晒?、?xì)胞大小和復(fù)雜程度，對照典型藻種純培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果相對位置，進(jìn)行水體中藻群的分組，圖片以BMP格式輸出。藻細(xì)胞濃度的計(jì)算以及藻群的統(tǒng)計(jì)通過Microsoft Excel 2019完成，圖表繪制使用Origin軟件。

高通量測序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存，對序列長度、模糊堿基、錯(cuò)誤堿基、低質(zhì)量堿基進(jìn)行質(zhì)量過濾，使用Mothur軟件進(jìn)行二次質(zhì)量篩選去除嵌合體，獲得最終的優(yōu)質(zhì)序列。運(yùn)用Uparse7.0軟件對97%相似水平下的OTU進(jìn)行聚類分析，采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類學(xué)分析，與Silva(Release132 http://www.arb-silva.de)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分別在各個(gè)分類水平域、界、門、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。OTU豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以確保不同樣品間的一致性，去除豐度小于3的OUT，去除注釋到葉綠體、線粒體的OTU，基于最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平。本研究采用空白對照法和質(zhì)量直方圖法進(jìn)行質(zhì)控分析，所有樣本的檢測程序和效果均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法的實(shí)證

2.1 實(shí)際水體的選擇與水樣的處理

金澤水庫是上海重要的飲用水水源地之一，來自太湖的原水流入太浦河后再進(jìn)入水庫，完成一系列的菌藻篩選和水質(zhì)凈化過程，屬于較典型的“湖泊-河流-水庫”復(fù)合型水環(huán)境系統(tǒng)，主要分為預(yù)處理區(qū)、生態(tài)凈化區(qū)和輸水區(qū)，營養(yǎng)級別較低，藻群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，呈現(xiàn)出較高的超微藻多樣性。本研究所用樣本取自上海金澤水庫，在不同采樣點(diǎn)和不同月份采集0.5 m水深處的表層水體各1 L，儲存于不透光且潔凈的塑料桶中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并保存于4 ℃冷庫中，本試驗(yàn)選取一部分具有代表性的樣本進(jìn)行分析。

水樣采集以后，一部分用于直接分析和分選，另一部分儲存用于后續(xù)或二次操作。每10 mL水樣裝入15 mL滅菌離心管中，添加戊二醛(最終濃度為0.1%)作為細(xì)胞固定劑[8]，液氮速凍，并保存在-20 ℃冰柜中，最大限度減少水樣中的細(xì)胞損失。使用前放置于37 ℃水浴鍋中解凍，并混合均勻。上樣前所有水樣需通過40 μm的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，重復(fù)操作3次，防止對儀器進(jìn)樣口造成阻塞。

2.2 超微藻細(xì)胞分析及濃度測定

利用試驗(yàn)采得的新鮮水樣進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，完成藻細(xì)胞的識別、群體劃分和濃度測量。根據(jù)在FSC軸藻類細(xì)胞與已知大小為2 μm熒光微球的相對位置，可將藻細(xì)胞劃分為超微藻(小于2 μm)和非超微藻(大于2 μm)，如圖4(a)所示。根據(jù)藻類熒光特性，將APC、PC5.5、PE、FSC、SSC坐標(biāo)軸兩兩組合，水樣中藻細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的分組特征，藻群之間位置越接近說明熒光組成和細(xì)胞特征越相似，如圖4(b)所示。藻群1藻藍(lán)蛋白含量很高，且與聚球藻純培養(yǎng)液在相同條件參數(shù)下的位置相近，被劃分為超微藍(lán)藻；與藻群1相比，藻群2含有更高的藻紅蛋白和相對較低的藻藍(lán)蛋白，被劃分為富含藻紅蛋白的超微藍(lán)藻；其他藻群屬于真核藻類，含有較高的葉綠素和較低的藻藍(lán)蛋白，根據(jù)葉綠素含量的不同以及與典型藍(lán)藻(Synechococcus)、綠藻(Chlorellavulgaris)、硅藻(Stephanodiscushantzschii)的純培養(yǎng)液的相對位置，藻群3和藻群4區(qū)分為超微綠藻和超微硅藻。夏季超微藻生物多樣性高于春季，8月水體樣本中超微藻的數(shù)量在103～105cell/mL，其中輸水口數(shù)量較多，超微藍(lán)藻為2.46×105cell/mL，富含藻紅蛋白的超微藍(lán)藻為2.78×103cell/mL，超微綠藻為9.61×103cell/mL，超微硅藻為2.56×104cell/mL。

圖4 藻群劃分 (a)超微藻和非超微藻劃分；(b)特征超微藻群劃分Fig.4 Division of Phytoplankton Groups (a) Division of Picophytoplankton and Nanophytoplankton； (b) Division of Picophytoplankton Groups

2.3 超微藻分選及高通量測序

本試驗(yàn)每個(gè)樣本分選約35 000個(gè)超微藻細(xì)胞，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)及PCR檢測報(bào)告驗(yàn)證，基因組DNA提取效果良好，高通量測序數(shù)據(jù)量足夠。得到平均長度為367的1 102 873個(gè)有效序列，與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共獲得相似水平在97%以上的236 OTUs，超微藻的注釋和分類按照Tranvik等[12]的描述。6個(gè)門類的超微藻被檢出，包括藍(lán)藻門(Synechococcus，Prochlorococcus)、綠藻門(Nephro-selmis，Tetraselmis，Choricystis，Nannochloris)、不定鞭藻門(Pseudo-nitzschia，Ochromonas，Thalassiosira、Chaetoceros)、異隱藻門(Cryptomonas，Teleaulax)、定鞭藻門(Emiliania，Chrysochromulina)和囊泡藻門(Dinophysis)。根據(jù)根據(jù)色素分析和豐度變化情況，判定流式細(xì)胞儀分析檢測到的藻群2(富含藻紅蛋白的超微藍(lán)藻)是聚球藻(Synechococcu)的其中一種，藻群4(超微硅藻)的主要組分是海鏈藻(Thalassiosira)。與傳統(tǒng)的過濾水樣16S rDNA測序方法進(jìn)行比較，除了普遍受到關(guān)注的超微藍(lán)藻聚球藻以外，流式細(xì)胞儀分選和23S rDNA高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)了更為豐富的超微藍(lán)藻和超微真核藻，更好地揭示了水體中超微藻的生物多樣性。與傳統(tǒng)方法的藻類占比(<10%)相比，此方法藻類OTU占比達(dá)到76.3%，異養(yǎng)模版的干擾大大降低，由于分選操作對目標(biāo)藻群的聚焦，相對豐度很低(<0.01%)的藻屬也能被檢測到。不能自發(fā)熒光但依然通過流式細(xì)胞儀分選與超微藻共同檢出的部分細(xì)菌，如疣微菌、厚壁菌和變形菌，可能緊密附著在超微藻細(xì)胞的表面未被去除，推測這些細(xì)菌與超微藻之間存在著共生關(guān)系[13]。

2.4 存在問題分析

盡管流式細(xì)胞儀結(jié)合高通量測序的這種方法在超微藻監(jiān)測的應(yīng)用中具有極大優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一些缺點(diǎn)，在今后的研究中應(yīng)注意以下兩個(gè)方面。第一，儀器因攜帶不便無法用于現(xiàn)場原位試驗(yàn)[14]，且對樣本濃度的要求較高，因此，通常需要對新鮮水樣進(jìn)行固定，如何選用合適的固定劑成為主要問題。較常用的是戊二醛和多聚甲醛，也可適量添加表面活性劑，盡管使用了固定劑，仍可能造成細(xì)胞損失，尤其是結(jié)構(gòu)較脆弱的超微藍(lán)藻，后續(xù)研究應(yīng)更多關(guān)注固定劑種類和濃度的選擇。第二，多細(xì)胞的絲狀藍(lán)藻，如偽魚腥藻、浮絲藻等，無法用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選[15]，應(yīng)采用其他輔助方法來彌補(bǔ)流式細(xì)胞儀對絲狀藍(lán)藻檢測不足的缺點(diǎn)。

3 結(jié)論

(1)通過流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了超微藻檢測方法體系的構(gòu)建。流式細(xì)胞儀對超微藻群進(jìn)行識別、計(jì)數(shù)和分選，23S rDNA高通量測序得到超微藻種屬信息，從而深入探究超微藻群落結(jié)構(gòu)在時(shí)間和空間上的動態(tài)變化規(guī)律。

(2)通過對取自上海金澤水庫實(shí)際水體樣本中超微藻的分析，檢驗(yàn)了此方法的可行性和有效性。分選操作和高通量測序方法的優(yōu)化極大減少了異養(yǎng)模版的干擾，獲得更多的超微藻序列，大大提高低相對豐度藻屬的檢出率。

(3)金澤水庫夏季水體中超微藻數(shù)量在103～105cell/mL，共檢出6個(gè)門類的超微藻，包括藍(lán)藻、綠藻門、不定鞭藻、異隱藻、定鞭藻和囊泡藻，超微藻的多樣性較高。