長(zhǎng)鏈非編碼RNA-EPIC1在前列腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

唐智國(guó) 魏 燦 邰 勝

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是嚴(yán)重威脅老年男性健康的惡性腫瘤，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家是男性發(fā)病率第一的惡性腫瘤。近年來(lái)，隨著我國(guó)民眾飲食結(jié)構(gòu)的變化，PCa的發(fā)病率也迅速升高，已成為我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類無(wú)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄功能的RNA，廣泛存在于人體組織中，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化、惡性轉(zhuǎn)變等多種生理病理過程，作用機(jī)制復(fù)雜。現(xiàn)已證實(shí)LncRNA在PCa的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。表觀遺傳誘導(dǎo)LncRNA-1(Epigenetically-induced lncRNA1,EPIC1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，在肺癌、膽管癌的進(jìn)展中起到重要作用。本文研究了EPIC1在PCa細(xì)胞系和病理組織中的表達(dá)情況，探討了EPIC1與PCa預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年3月至2020年1月在合肥市第八人民醫(yī)院、合肥市第二人民醫(yī)院及安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷為PCa并手術(shù)切除的10例病理標(biāo)本，取新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>3 cm并經(jīng)病理檢查確認(rèn)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn))。另收集2012年1月至2020年1月上述3家醫(yī)院病理科貯存的有詳細(xì)隨訪信息的69例PCa手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，患者平均年齡(69.70±6.64)歲，均行PCa根治術(shù)并輔以術(shù)后內(nèi)分泌治療。以上組織均在手術(shù)切除后，迅速浸于RNA保存液并超低溫冷凍保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬均知情并簽字同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人PCa細(xì)胞系(PC3、DU145)和人前列腺正常細(xì)胞系(RWPE-1)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行研究。將PCa細(xì)胞接種于6孔板后，隨機(jī)分為siR-EPIC1組與siR-NC組，每組18株。用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入siRNA。siR-EPIC1組引物序列：上游5’-CCUUCAGACUGUCUUUGAA-3’，下游5’-AGUGUGGCCUCAGCUGAAA-3’；siR-NC組引物序列：上游5’-AGACCUUCAUCAAAAACAU-3’，下游5’-GAGCUAAAACGGAGCUUUU-3’。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)分析 取40 mg組織標(biāo)本，Trizol法提取總RNA，再用Omniscript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Select Master Mix試劑盒、ABI PRISM 7000進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)EPIC1的表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱5 min,95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算EPIC1表達(dá)量。EPIC1引物序列：上游5’-TATCCCTCAGAGCTCCTGCT-3’，下游5’-AGGCTGGCAAGTGTGAATCT-3’；內(nèi)參U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8法) 將細(xì)胞接種于96孔，接種密度5×10個(gè)/孔，分別培養(yǎng)1、2、3、4和5 天后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的CCK-8檢測(cè)液，作用30 min后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell法) 將預(yù)先配置好的Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室底膜，將200 μL無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液接種于上室，接種密度每毫升2.5×10個(gè)，下室置入700 μL含血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄上室培養(yǎng)基，棉簽拭去上室里的細(xì)胞，多聚甲醛固定細(xì)胞后，用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)從上室侵襲至下室的細(xì)胞數(shù)。

1.6 隨訪 最后隨訪日期為2020年8月，全部患者中位隨訪31.3個(gè)月(8～67個(gè)月)。隨訪的內(nèi)容主要包括患者身體的一般狀況、生存狀態(tài)等。

2 結(jié)果

2.1 EPIC1在PCa細(xì)胞系和PCa組織中的表達(dá)情況 EPIC1在PC3、DU145中的表達(dá)量分別為(0.12±0.02)和(0.20±0.03)，在RWPE-1中的表達(dá)量為(0.01±0.001)。與RWPE-1細(xì)胞相比，EPIC1在PC3、DU145細(xì)胞中的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

RWPE-1 PC3=10.515,

P

=0.001；

t

RWPE-1 DU145=17.144,

P

<0.001)。EPIC1在患者PCa組織中的平均表達(dá)量為(0.61±0.05)，在癌旁正常組織中的平均表達(dá)量為(0.06±0.003)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=23.687，

P

<0.001)。2.2 EPIC1對(duì)PCa細(xì)胞增殖能力的影響 在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)入siRNA后的第1、2、3、4和5天，siR-EPIC1組和siR-NC組的吸光度均有升高的趨勢(shì),不同組別和處理時(shí)間對(duì)PC3細(xì)胞增殖能力無(wú)交互作用(

P

>0.05)。siR-EPIC1組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度均低于siR-NC組，細(xì)胞增殖能力下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 PC3細(xì)胞siR-EPIC1組與siR-NC組各時(shí)間點(diǎn)吸光度比較

在DU145細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入siR-EPIC1和siR-NC后，不同組別和處理時(shí)間對(duì)DU145細(xì)胞增殖能力無(wú)交互作用(

P

>0.05)。相較于siR-NC組，siR-EPIC1組細(xì)胞的增殖能力下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 DU145細(xì)胞siR-EPIC1組與siR-NC組各時(shí)間點(diǎn)吸光度比較

2.3 EPIC1對(duì)PCa細(xì)胞侵襲能力的影響 在PC3細(xì)胞中，siR-NC組侵襲的細(xì)胞數(shù)為(259.25±43.59)，siR-EPIC1組為(73.25±25.75)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.348,

P

<0.001)。在DU145細(xì)胞中，siR-NC組侵襲的細(xì)胞數(shù)為(182.75±35.52)，siR-EPIC1組為(53.25±17.13)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=6.568,

P

<0.001)。Tranwell檢測(cè)顯示，siR-EPIC1抑制了PC3和DU145細(xì)胞的侵襲能力。見圖1。

圖1 siR-EPIC1對(duì)PCa細(xì)胞的侵襲能力的影響

2.4 EPIC1的表達(dá)水平與PCa患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 采用RT-PCR法分別檢測(cè)EPIC1在69例PCa組織中的表達(dá)量，再以表達(dá)量的平均值為界，將患者分為EPIC1高表達(dá)組(

n

=38)和低表達(dá)組(

n

=31)。相較于EPIC1低表達(dá)組，EPIC1高表達(dá)組的Gleason評(píng)分高，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯，TNM分期晚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表3。

表3 EPIC1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者臨床病理參數(shù)比較[例(%)]

2.5 EPIC1的表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系 69例患者總體的3年生存率為62.5%，其中EPIC1高表達(dá)組患者的3年生存率為53.7%，低表達(dá)組為78.1%。Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，EPIC1高表達(dá)組患者生存曲線在各個(gè)時(shí)間段均低于低表達(dá)組，兩組患者生存率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.040)。見圖2。

圖2 EPIC1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存分析

3 討論

生物信息學(xué)研究表明，LncRNA在多種人類腫瘤細(xì)胞中起到抑癌或促癌的作用。EPIC1是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，表觀遺傳學(xué)分析確定它與癌基因

Myc

相互作用，并促進(jìn)癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)展，并且在肺癌、膽管癌等腫瘤的核苷酸序列處形成EPIC1-

Myc

復(fù)合體，促進(jìn)

Myc

的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并增強(qiáng)下游MYC、Cyclin A1、CDC20和CDC45等蛋白分子的表達(dá)，加速細(xì)胞分裂和周期進(jìn)展，發(fā)揮致癌作用。然而EPIC1與PCa的關(guān)系尚未有研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，EPIC1在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于正常前列腺RWPE-1細(xì)胞系，提示EPIC1對(duì)PCa的發(fā)生和轉(zhuǎn)移起到一定作用。Li等研究發(fā)現(xiàn)，EPIC1能激活MYC蛋白下游的Cyclin A/D、CDK9等靶分子，加速細(xì)胞周期G1/S/G2的進(jìn)程。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，EPIC1能夠促進(jìn)MEF2D蛋白復(fù)合體的泛素化進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的活力和侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPIC1在PCa組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，進(jìn)而從細(xì)胞學(xué)和人體組織標(biāo)本2個(gè)層面驗(yàn)證了EPIC1的表達(dá)差異，證實(shí)了EPIC1對(duì)PCa具有促進(jìn)作用。

本研究采用siRNA技術(shù)抑制EPIC1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)PCa細(xì)胞的增殖和侵襲均明顯下降，表明EPIC1具有促進(jìn)PCa細(xì)胞分裂增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的功能。目前，對(duì)于EPIC1促癌機(jī)制的研究主要集中于EPIC1-MYC復(fù)合體的功能。研究表明MYC家族蛋白能促進(jìn)PCa細(xì)胞的分裂增殖，并能誘導(dǎo)PCa的激素抵抗性。筆者認(rèn)為，EPIC1可能在

Myc

基因表達(dá)和MYC蛋白功能調(diào)控中扮演重要作用，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生調(diào)控作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，癌組織中的EPIC1水平越高，患者的Gleason評(píng)分越高、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越明顯、TNM分期越晚。生存分析發(fā)現(xiàn)，EPIC1高表達(dá)組患者的存活率低于EPIC1低表達(dá)組，表明EPIC1對(duì)患者體內(nèi)PCa細(xì)胞的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力具有促進(jìn)作用，同時(shí)EPIC1也具有預(yù)測(cè)患者生存期的作用。一項(xiàng)針對(duì)111例晚期乳腺癌患者的研究表明，EPIC1高表達(dá)的患者也常合并Ki-67的高表達(dá)，易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移，3年存活率較低，而且對(duì)紫杉醇-順鉑化療方案具有耐藥性。筆者將會(huì)對(duì)前列腺癌化療耐藥與EPIC1的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。綜合目前文獻(xiàn)資料，本研究首次在PCa中研究了EPIC1與患者的生存和預(yù)后的關(guān)系，表明EPIC1有希望成為判斷PCa患者預(yù)后的有效的輔助因子。但本研究為單一中心研究，且納入病例數(shù)依然偏少，后續(xù)仍需多中心大樣本的研究，以進(jìn)一步發(fā)掘EPIC1的作用機(jī)制和臨床意義。

綜上所述，本研究證實(shí)了新型LncRNA-EPIC1對(duì)PCa的促進(jìn)作用，EPIC1能提高PCa細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)PCa的惡性程度。針對(duì)EPIC1的靶向治療方案有可能成為PCa治療的新手段。