一株誘導粘細菌子實體形成的被捕食菌的篩選及分子鑒定

原紅娟, 朱紅惠

一株誘導粘細菌子實體形成的被捕食菌的篩選及分子鑒定

原紅娟1,2, 朱紅惠2,*

1 運城學院生命科學系, 山西運城 044000 2 廣東省微生物研究所, 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室、廣東省菌種保藏與應用重點實驗室、廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070

為篩選適宜于誘導粘細菌子實體形成的被捕食菌, 利用誘導分離的方法, 從酵母菌、革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌共30株菌中進行篩選, 利用掃描電鏡觀察形態特征, 通過16S rRNA確定系統分類地位, 并對其分離培養基進行優化。獲得一株被捕食菌GIM1.767, 經透射電子顯微鏡觀察長約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65 μm, 無鞭毛, 分子鑒定為s; 對分離培養基進行優化, 發現添加1% 酵母粉的WCX培養基, 對粘球菌屬能更好的分離誘導。分離得到菌株, 對挖掘粘細菌資源提供一些參考價值。

被捕食菌; 分離純化; 粘細菌

0 前言

粘細菌(myxobacteria)是一類可以通過分泌粘液來執行滑行運動的革蘭氏陰性桿菌, 能夠產生豐富的結構新、種類多及作用機理新穎的活性物質, 是繼放線菌之后的又一重要藥源微生物新類群[1–2], 具有重要的潛在開發應用前景[3]。

粘細菌在環境中廣泛存在, 并在一定的條件下形成肉眼可見的子實體[4-6]。在低營養的培養基上, 能夠形成粘液豐富的、薄而擴展的菌落[7-9], 由其分泌的胞外粘液使子實體不易分散, 粘細菌生長具有密度依賴性, 單細胞不易萌發生長[10]且容易被污染; 在營養豐富的培養基上, 粘細菌不形成子實體只形成不擴散的菌落, 造成粘細菌不能與其他細菌分開[11-12]。除此之外, 粘細菌生長緩慢, 易被其他生長迅速的菌覆蓋或污染[13]。粘細菌的這些特性使得在分離純化粘細菌過程中存在許多問題, 也是制約一些研究者對其研究的主要原因。

粘細菌作為微生物中的捕食菌(Micropredators), 可以捕食和裂解其他活的或死的微生物[14-15], 主要通過粘細菌產生的胞外活性物質如細胞裂解酶、抗生素、核酸酶、酯酶、蛋白酶和多糖酶裂解其他微生物細胞, 作為小分子物質來滿足自身的營養需求。根據其食性粘細菌分為兩大類群, 分別為溶細菌類群(Bacteriolytic group)和溶纖維素類群(Cellulolytic group)。粘細菌除捕食細菌外, 還可以真菌, 如酵母菌、真菌和綠藻。因其細胞結構與組分的不同, 使粘細菌對被捕食菌裂解的難易及嗜好不同。

熱帶森林土壤和腐爛的樹木是分離粘細菌, 發現新的粘細菌資源最好的來源[16]。而越南是典型的熱帶地區, 有豐富的熱帶原始森林, 因此, 從熱帶原始森林腐木或土壤中分離粘細菌, 極有可能發掘到大量的粘細菌新資源, 得到功能新穎、遺傳背景多樣、且有重要利用價值的粘細菌資源, 從而為發現粘細菌新的活性物質和新的功能提供物質基礎。

本研究針對樣品的特性, 利用越南的土樣篩選出誘導效果較好的被捕食菌, 并對其進行分子鑒定。依據誘導過程中存在的問題[17-19], 以及不同類群的粘細菌食性不同, 篩選的被捕食菌結合改良誘導培養基, 使樣品中的粘細菌更易誘導分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

酵母菌:GIM2.6、GIM2.9、GIM 2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM2.132、GIM2.134、GIM2.149、GIM2.159、GIM2.173。

革蘭氏陰性菌:GIM1.223、GIM1.236、GIM1.224、GIM1.279、GIM1.767、GIM1.323、GIM1.205、GIM1.265、GIM1.331、GIM1.379、GIM1.767。

革蘭氏陽性菌:GIM 1.221、GIM1.276、GIM1.143、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058、GIMT1.044、GIMT 1.249、XJ1、XJ15。

以上菌種均由廣東省微生物菌種保和藏中心提供, GIM1.767、XJ1、XJ15為本實驗室在新疆鹽堿地土壤中篩選的被捕食菌。

1.1.2 主要培養基

① CY培養基、NA培養基、MRS培養基、VY/2培養基、水瓊脂培養基(WCX)[20]

② R2A合成培養基

改良WCX培養基: CaCl2·2H2O 0.1%, 釀酒酵母1%, 瓊脂1.5%, pH 7.2。

改良WCX培養基: CaCl2·2H2O 0.1%, 胰蛋白胨0.3%, 瓊脂1.5%, pH 7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理

用加放線菌酮(終濃度100 μg·mL–1)的無菌水浸泡土樣過夜, 用3K30C 型冷凍離心機(德國SIGMA公司)離心5 min(8000 r·min–1), 棄上清。

1.2.2 分離粘細菌

①將革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌接種于NA液體培養中, 37 ℃ 振蕩培養24 h, 酵母菌接種于MRS液體培養基中, 28 ℃ 振蕩培養24 h。

②將30種菌液各取100 uL, 涂布于CY平板上, 過夜培養, 將處理好的土樣, 接入長滿菌的CY平板上, 30℃下誘導培養, 每個處理重復三次。

③3天后置于在LEICA001型體式鏡(德國LEIKA公司)下觀察, 并挑取子實體于VY/2培養基上純化。

1.2.3 透射電鏡(transmission electricity microscope, TEM)觀察[20-21]

1.2.4 促進粘細菌子實體形成效果評價

取對數生長期的被捕食菌液100 uL, 涂布于新鮮的CY培養基上, 每個樣品三個重復, 1h 晾干后, 將粘細菌用針頭接種至CY培養基上, 三天后觀察拍照, 評價子實體形成效果。

1.2.5 DNA的提取

采用改良CTAB法[22]提取純培養物DNA。

1.2.6 PCR擴增

16S rRNA擴增使用細菌通用引物[23-24], 引物由廣州英俊測序公司合成。

1.2.7 系統發育分析

將菌株16S rRNA基因序列利用BLAST搜索軟件在GenBank數據庫中進行相似性搜索, 使用CLUSTAL.X[25]軟件進行序列比對, 采用Neighbor- joining[26]構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 被捕食菌的初步篩選

利用革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌各10種菌株(見1.1.1), 初步對越南三個土壤樣品進行誘導研究, 由表1可知: ①從總體誘導效果上看革蘭氏陰性菌誘導效果最好, 其次酵母菌, 革蘭氏陽性菌誘導效果最差; ②革蘭氏陽性菌能分離得到的粘細菌, 酵母菌和革蘭氏陰性菌均能分離得到, 即革蘭氏陽性菌分離得到的粘細菌種屬較少, 只有和兩個屬, 且主要為。③分離粘細菌顏色都較鮮亮, 但由于酵母菌在解剖鏡下顏色無色透亮, 因此分離一些顏色較淺的粘細菌比較困難, 或者會容易漏看(如圖1 I), 且多數酵母菌誘導時, 如GIM2.6、GIM2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM 2.132、GIM2.149和GIM2.173, 培養基上易出現白色且硬的片狀物質(見表1), 對純化過程造成一定的影響(如圖1 C)。④霉菌污染嚴重(如圖1 E、F、H), 特別是革蘭氏陽性菌,GIM1.276、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058和XJ15, 在4-5天就被霉菌覆蓋, 這可能與菌體自身的代謝有關。⑤由表1被捕食菌誘導效果可知, 土壤中易誘導的在本樣品中通過常規培養(CY培養基)不易誘導出, 且多數在2周左右才誘導出, 對之后的純化工作帶來很大的困難。

綜合以上結果, 在30株誘導菌中, 優先選擇革蘭氏陰性菌, 而革蘭氏陰性菌中, 誘導效果最好的菌株為GIM1.767(見表1)。

2.2 被捕食菌的形態觀察

利用日立H-7650型透射電子顯微鏡, 利用對被捕食菌GIM1.767的形態進行了觀察, 結果如圖2所示, 長度約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65μm, 無鞭毛。

注: A.E. coli GIM1.223; B. Staphylococcus sciuri GIMT1.249; C.Saccharomyces cerevisiae GIM2.132; D. Erwinia persicina GIM1.331; E. Klebsiella pneumonia GIM1.279; F. Candida utilis GIM2.9; G.Saccharomyces cerevisiae GIM2.127; H.Serratia marcescens GIM1.323; I.Debaryomyces hansenii GIM2.149)。

Figure 1 Rendering of three types of some prey bacteria induce fruiting body

表1 被捕食菌的誘導效果

2.3 被捕食菌生長曲線的測定

被捕食菌的誘導效果, 通常利用對數生長期的菌體進行涂布或劃線誘導。由圖3(A圖) 菌株GIM1.767的生長曲線可知, 菌株GIM1.767在2.0 h進入對數生長期, 生長1.5 h后達到穩定生長期。而的對數生長期較長(圖3 B圖), 從2 h開始對數生長期, 至7 h達到穩定生長期, 即的的對數生長期大約5小時, 較菌株GIM1.767的對數生長期長近3.5h。

2.4 菌株GIM1.767的分子鑒定

將被捕食菌GIM1.767的16S rRNA基因的序列利用BLAST搜索軟件在GenBank數據庫中進行相似性搜索, 并調取相關種屬的相近模式菌的16S rRNA序列, 以ATCC 25416T為外類群構建系統發育樹, 結果顯示, 被捕食菌GIM1.767與菌株S1Y1- bLLT、NG-R17T和DPN7T的相似性均達99%。使用CLUSTAL.X(Thompson., 1997)軟件進行序列比對, 利用MEGA4.0的Neighbor-joining構建系統發育樹(見圖4), 系統發育分析顯示, 菌株GIM1.767與的進化距離較近, 應歸類于。

圖2 被捕食菌GIM1.767透射電鏡形態圖(0.5 μm)

Figure 2 Transmission electricity microscope observation of predation GIM1.767

注: A. GIM1.767的生長曲線; B. E. coli的生長曲線。

Figure 3 Growth curve of prey bacteria

注: 標尺代表進化樹的進化距離, 括號中的內容代表菌株的登錄號, Burkholderia cepacia ATCC 25416T作為外類群

Figure 4 Molecular identification of strain GIM1.767 based on 16S rRNA gene sequence

2.5 菌株GIM1.767誘導粘細菌子實體形成的培養基的優化

分離越南土壤樣品的過程中, 發現土壤中易分離的粘球菌屬不易誘導, 或在10至14天才被誘導出, 但此時因霉菌污染使其不易純化, 因此, 設計了兩種優化培養基, 以基礎的WCX分離培養基為對照, 分別在WCX培養基中添加適量的酵母提取物(1%)、胰蛋白胨(0.3%)及R2A培養基作為分離培養基, 利用誘導菌GIM1.767進行劃十字線分離粘細菌。由表2、圖5可知, 添加胰蛋白胨的分離培養基誘導不出或能誘導出極少數的粘細菌, 且形成的子實體不明顯或無子實體形態。其余三種分離培養基, 誘導出的粘細菌種類和顏色差異不大, 但誘導粘球菌屬在時間上有差異, WCX需12—14天, R2A培養基10—12天, WCX添加酵母提取物的培養基誘導時間最短, 需5—7天。誘導的粘細菌子實體大小上, WCX與添加酵母提取物的WCX無明顯差異, 但R2A誘導的粘細菌子實體較小。

表2 幾種誘導粘細菌子實體形成的培養基

注: A. WCX培養基上誘導的M. Xanthus; B. 添加1%酵母提取物的WCX培養基上誘導的M. Xanthus; C. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培養基上誘導的M. Virescens; D. R2培養基上誘導的M. Xanthus; E. 添加1%酵母提取物的WCX培養基上誘導的C. Coralloides; F. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培養基上誘導的C.coralloides; G. WCX培養基上誘導的Cystobacer; H. 添加1%酵母提取物的WCX培養基上誘導的Cystobacer; I. R2培養基上誘導的Cystobacer。

Figure 5 Rendering of three types of some prey bacteria GIM1.767 induce fruiting body (day 8)

以上結果顯示, 分離越南土壤樣品最適宜的培養基為WCX添加酵母提取物的培養基。

3 討論

粘細菌的研究自1809年至今已經歷了200多年, 由于分離純化技術的限制, 目前已經描述的粘細菌只有7個科, 24屬, 56個種[27-29]。分離技術限制的原因之一就是被捕食菌, 一般分離粘細菌通常選用易捕食的革蘭氏陰性大腸桿菌[30], 但被捕食菌也可以選取酵母菌或革蘭氏陽性菌。粘細菌作為微生物群體中的捕食者, 由于其偏好性或捕食機理的差異, 相同環境下粘細菌捕食的對象可能不同。李百元等[31]在利用被捕食細菌誘導分離新疆鹽堿地粘細菌中發現, 在相同的培養環境下,只捕食了革蘭氏陽性菌。本研究利用被捕食菌捕食的偏好性不同, 選取30種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌對越南三個樣品進行誘導研究, 結果發現革蘭氏陰性菌誘導效果最好, 子實體明顯, 顏色鮮艷, 誘導的種類較多, 且不會產生白色片狀物質; 并結合各種誘導因素(見表1)選取了一株革蘭氏陰性菌GIM1.767作為最佳的被捕食菌; 通過透射電子顯微鏡觀察發現, 被捕食菌GIM1.767的形態為無鞭毛, 長度約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65 μm。菌株GIM1.767的對數生長期在2.5—4 h。在CY培養基上, 被捕食菌促進粘細菌子實體形成效果顯示, 菌株GIM1.767比誘導的子實體形成的時間提早2天左右, 為后期分離純化粘細菌不易被霉菌污染提供了有利的時間保障, 通過16S rRNA基因的分子鑒定, 菌株GIM1.767屬于。

土壤微生物是土壤生態系統中最為重要的部分, 是土壤分解系統中的主要成分, 而捕食菌通過捕食其他微生物, 來控制土壤微生物的數量, 從而影響微生物的群體結構[32-34]。通過16S rRNA基因的分子鑒定, 菌株GIM1.767屬于, 經培養基的優化, 其分離粘細菌最佳培養基為WCX添加1%的酵母提取物的培養基。

通過本實驗篩選得到菌株GIM1.767, 說明不同生境的粘細菌對被捕食菌的偏好性不同, 其原因可能與被捕食產生的氣體、代謝產物及其滑行機制有關[35], 需進一步研究, 其研究結果為分離純化粘細菌提供一些應用參考價值。

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Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies

YUAN Hongjuan1,2, ZHU Honghui2,*

1 Department of Life Science, Yuncheng University, Shanxi 044000, China 2 Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology. Guangzhou 510070, China

In order to screen the predatory bacteria suitable for inducing the formation of myxobacteria fruiting bodies, the induced separation method was performed to select 30 stains from microbes including yeasts, Gram negative and Gram positive bacteria. Subsequently, the morphological characteristics were observed by scanning electron microscope and phylogentic position was analyzed based on 16S rRNA. In addition, the isolation medium was optimized. One prey bacterium GIM1.767 was identified as. According to scanning electron microscope, its length and width were 1.2-1.24 μm and 0.6-0.65 μm, respectively, without flagella. Optimization of isolation medium found that the WCX medium with 1% yeast extract was effective to separate thestrains. Isolation of strainhad certain reference application value to excavate myxobacteria resources..

preybaceria; islation purification; myxobacteria

原紅娟, 朱紅惠. 一株誘導粘細菌子實體形成的被捕食菌的篩選及分子鑒定[J]. 生態科學, 2021, 40(4): 113–120.

YUAN Hongjuan, ZHU Honghui. Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies[J]. Ecological Science, 2021, 40(4): 113–120.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.013

Q936.2

A

1008-8873(2021)04-113-08

2020-02-07;

2020-05-18

山西省面上青年基金項目(No. 201601D202061); 廣東省國際合作項目(No.2012B050700009); 運城學院博士科研啟動項目(No.YQ-2017009);山西省重點學科建設經費資助(No.FSKSC)

原紅娟(1978—), 女, 山西運城, 博士, 副教授, 主要從微生物資源開發研究, E-mail:yhj1793@163.com

朱紅慧, 女, 博士, 主要從事微生物研究, E-mail: zhuhh@gdim.cn