CD40免疫檢查點人源化小鼠的制備及在抗體藥物研究中的應用*

張 靜 張 贊 趙 磊 郭雅南 黃 蕤 許立達

(1.北京化工大學，北京 100029)(2.百奧賽圖(北京)醫藥科技有限公司，北京 101111)

近年來使用靶向程序性死亡受體1(PD-1)、程序性死亡受體1配體(PD-L1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)等免疫檢查點藥物進行腫瘤免疫治療越來越受到關注。其中，臨床前動物模型選擇是腫瘤免疫治療中面臨的十大重要挑戰之一[1]。通過基因工程將人類基因插入動物體內，以提高動物在人類疾病研究中利用性，在疾病的基礎研究和藥物研究中都得到了廣泛應用。基因人源化小鼠通過插入人類基因來替代相應的內源性小鼠基因使小鼠人源化，被廣泛應用于人類疾病模型建立、腫瘤研究以及生物制藥研究中[2-4]。單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)是臨床治療中成功率較高的一類藥物[5-7]，但是人類和嚙齒動物之間的某些單克隆抗體交叉反應性差會嚴重限制其臨床前研究進程。目標蛋白的轉基因人源化可以為在小鼠中驗證人類單克隆抗體提供一種有效的方法。

CD40是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員，是一類共激活信號分子，主要由抗原提呈細胞(APC)如樹突狀細胞、巨噬細胞等免疫細胞和非免疫細胞，特別是腫瘤內皮細胞、上皮細胞和造血祖細胞，以及某些腫瘤細胞特別是B細胞惡性腫瘤和淋巴瘤表達[8-10]，其配體為CD40 L，主要在血小板、肥大細胞、嗜堿性粒細胞和活化的T細胞上表達[11]。CD40與它的配體CD40 L相互作用可以激活APC，為T細胞活化提供共激活信號，啟動效應性細胞毒T細胞反應。構建CD40人源化小鼠模型能夠為CD40單克隆抗體藥物開發以及在腫瘤治療中的安全應用研究提供更多可選擇的動物模型。本研究通過構建CD40人源化小鼠模型并對其CD40表達情況進行鑒定，來進一步驗證這種模型對于評價人CD40激活型抗體藥物臨床前藥效作用和安全性的可能。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

健康的SPF級C57BL/6小鼠、昆明(KM)小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。CD40人源化小鼠(B-hCD40)由百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0004；本研究方案經百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司的動物護理和使用委員會批準，實驗動物倫理審查編號：BAP-BJ-PS-101、BAP-BJ-PS-102。小鼠MC38結腸癌細胞購自舜冉上海生物科技有限公司；Cas9 mRNA和sgRNA的體外轉錄試劑盒MEGA shortscript T7 Kit和純化試劑盒MEGA clear Kit 購自Life Technologies；southern消化酶StuI和SpeI購自NEB；southern雜交液和地高辛發光檢測試劑盒購自Roche；探針引物合成于金唯智生物科技有限公司；RT-PCR引物合成于Thermo fisher scientific；流式檢測抗體均購自Biolegend，包括鼠抗CD45(30-F11)、TCRβ(30-F11)、CD19(6D5)、CD4(GK1.5)、 CD8(53-6.7)、CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、NK1.1(PK136)、F4/80(8M8), Gr1(RB6-8C5)、Ly6G(1A8)、Foxp3(FJK-16S)、CD40(3/23)、PD-1(RMP1-30)、TIM3(RMT3-23)、Eomes(Dan11mag)、T-bet(4B10)和抗人CD40(HB14)；激活型抗人CD40單克隆抗體(CD40 Ab)由百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1sgRNAs的篩選：通過 CRISPR 設計網站(http:∥crispr.mit.edu)設計了多個sgRNA，分別靶向小鼠CD40 exon2和exon7的兩個位點。使用sgRNA活性檢測系統UCATM(Biocytogen)篩選出兩個靶向活性高的sgRNA來進行后續實驗。

1.2.2Cas9 mRNA和sgRNA的制備：通過 PCR 擴增將Cas9 mRNA和sgRNA序列添加到含T7啟動子的Cas9或sgRNA模板上。將該模板使用MEGA shortscript T7試劑盒進行體外轉錄。使用MEGAclear試劑盒將Cas9 mRNA和sgRNA純化，然后用RNase-free水洗脫。

1.2.3打靶載體構建：我們設計的打靶載體含有人CD40基因序列(取代小鼠CD40序列)和左(～1 500 bp)、右(～1 500 bp)兩個同源臂的序列作為打靶模板，修復由Cas9/sgRNA 產生的雙鏈斷裂。小鼠CD40的部分編碼區域(小鼠第20～192個氨基酸)被人CD40(人第 20～192個氨基酸)取代。

1.2.4顯微注射：C57BL/6雌性小鼠和KM小鼠品系分別作為胚胎供體和假孕代孕母體。將超排的雌性 C57BL/6小鼠(3～4周齡)與雄性C57BL/6小鼠交配，收集受精胚胎。將不同濃度的 Cas9 mRNA、sgRNA 和供體載體混合，共同注射到單細胞期受精卵的細胞質中。注射后，將存活的受精卵轉移到 KM假孕雌性小鼠的輸卵管中。

1.2.5Southern印跡雜交：從小鼠尾部提取的基因組DNA用SpeI或StuI酶消化，在0.8%瓊脂糖凝膠上分離，并轉移到帶正電荷的尼龍膜上。使用含有地高辛(DIG)標記的探針的雜交液在42 ℃下與膜過夜雜交。隨后使用DIG發光檢測試劑盒檢測雜交信號。

對于探針的制備，使用 Taq DNA聚合酶通過 PCR 程序制備 3′-外部和內部探針，根據生產商說明摻入DIG-11-dUTP標記探針使用以下引物擴增3′-外部探針(358 bp)：5′-TCTGCAGAGCCA AGCATAGCAAAGT-3′和3′-GAGCCAGCTCAAAGC AGAGCTATCA-5′。對于內部探針(368 bp)使用以下引物：5′-GGTCAAGCAGATTGGTAAGT GGCTC-3′和3′-GAGGGGGACATTAACCATCAT GG-5′。

1.2.6RT-PCR：使用總RNA提取試劑盒提取6周齡的小鼠脾臟總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以GAPDH為內參，檢測小鼠CD40和人CD40的mRNA的表達。

使用以下引物擴增GAPDH(269 bp)：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和3′-GCCTGCTTC ACCACCTTCTT-5′。小鼠CD40(413 bp)使用以下引物：5′-TGAGAAGACCCAATGCCACC-3′和3′-TCCGGGACTTTAAACCACAGAT-5′。人源化CD40(408 bp)，使用以下引物：5′-GTGCTGTTCTTTG TGCCAGC-3′和3′-AGGTCTTTGGTCTCACAGCTT-5′。

1.2.7流式細胞術檢測小鼠CD40蛋白表達及免疫細胞分群：分別對C57BL/6小鼠和B-hCD40小鼠腹腔注射7.5 μg mCD3抗體，24 h后收集小鼠脾臟細胞檢測B-hCD40小鼠人源CD40蛋白的表達水平。分別收集C57BL/6和B-hCD40小鼠脾臟細胞，對小鼠的各個淋巴細胞群包括B細胞、T細胞、NK細胞、DC細胞、粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、CD4+陽性細胞、CD8+細胞和Treg細胞進行流式分析。對收集到的小鼠脾臟組織進行研磨，然后使用ACK紅細胞裂解液進行裂解，去除紅細胞。500 g離心5 min后，將得到的脾臟細胞與熒光直接標記抗體在4 ℃條件下避光孵育細胞30 min，PBS洗滌后進行重懸，上機進行檢測。

1.2.8HB14抗體的體內藥效評價：將結腸癌MC38細胞以5×105個/0.1 mL接種于雌性B-hCD40小鼠的右側皮下，待腫瘤生長到約100 mm3時，按腫瘤體積挑選10只小鼠隨機分組，每組5只，共2組，分別為溶劑對照PBS組和CD40 Ab(3 mg/kg)組。所有組給藥途徑均為腹腔注射，每周給藥2次，連續給藥6次。給藥期間和觀察期間每周測量2次小鼠體質量和腫瘤體積，并記錄測量值。實驗結束時，動物安樂死，計算相對腫瘤生長抑制率(TGI)。

1.2.9HB14抗體的體內毒性評價：挑選9只B-hCD40小鼠，按體質量隨機分組，每組3只，共3組，分別為PBS溶劑對照組、CD40 Ab(20 mg/kg)組和CD40 Ab(1 mg/kg)組。挑選6只C57BL/6 N小鼠按體質量隨機分組，每組3只，共2組，分別為CD40 Ab(20 mg/kg)和CD40 Ab(1 mg/kg)組。所有組給藥途徑均為尾靜脈注射，在第0、3、7、10天給藥，共給藥4次。給藥期間和觀察期間每周測量2次小鼠體質量，并記錄測量值。第11天取血檢測血生化指標谷丙轉氨酶ALT和谷草轉氨酶AST。第14天結束實驗，將小鼠放入10%甲醛固定，用于病理HE染色觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 B-hCD40小鼠打靶策略

CD40是一種I型跨膜糖蛋白。小鼠CD40(mCD40)基因位于2號染色體上，小鼠CD40前體蛋白編碼289氨基酸(aa)，主要由N端信號肽(19aa)、胞膜外區(193aa)、跨膜區(22aa)和細胞質區(74aa)組成。人CD40基因位于20號染色體上，人CD40其前體含有277aa，由N端信號肽(20aa)、胞膜外區(193aa)、跨膜區(22aa)和胞內區(62aa)組成。其中，人CD40蛋白與小鼠CD40蛋白的同源性為61%。本研究中使用人CD40(20aa-192aa)替換小鼠CD4(20aa-192aa)，生成嵌合的CD40蛋白，胞內區為鼠源的蛋白，能正常傳遞細胞內的信號，不影響正常的小鼠生物活性。利用CRISPER/Cas9基因打靶技術，構建針對小鼠CD40基因的sgRNA。5′端sgRNA序列(5′-3′)：GACAAACAGTACCT CCACGA；3′端sgRNA序列(5′-3′)：CGCATCCGG GACTTTAAACC；5′端和3′端的PAM序列分別為5′TGG和3′TGG。在Cas9系統切開DNA鏈后通過同源重組將人CD40片段重組到靶位點上，打靶載體圖譜如圖1所示。同時制作攜帶人CD40基因片段的打靶載體，與Cas9 mRNA、sgRNA共同顯微注射受精卵，移植到假孕雌性的輸卵管中，獲得F0代小鼠，通過PCR以及測序驗證陽性小鼠。

2.2 B-hCD40小鼠雜合子及純合子的構建

將陽性F0代小鼠和背景鼠(C57BL/6)回交，獲得F1代小鼠，通過PCR和測序進行驗證。將測序陽性的F1代陽性小鼠(1EJ24-29、1EJ24-31、1EJ24-32、1EJ24-36)再進行southern雜交驗證(圖2)。A探針(也稱5′探針)能夠特異性結合人CD40基因片段，小鼠鼠尾基因組DNA通過Spel酶消化后，能被A探針檢測到，條帶大小為8.8Kb，但是WT的小鼠染色體不能被檢測到；3’探針設計在小鼠CD40基因9號外顯子下游，小鼠鼠尾基因組DNA通過Stul酶消化后，WT的小鼠染色體和人源化的染色體都能被檢測到。獲得F1代southern陽性小鼠，將F1代陽性小鼠交配，獲得純合的F2小鼠。

圖2 CD40人源化陽性小鼠的構建

2.3 B-hCD40小鼠人CD40的mRNA及蛋白水平鑒定

反轉錄PCR分析顯示人CD40的mRNA在純合人源化小鼠的脾臟中表達，而在野生型中不表達。小鼠CD40的mRNA僅在野生型小鼠的脾臟組織中表達，在純合子小鼠中無法檢測到，如圖3A所示。

在野生型小鼠中，小鼠CD40蛋白經過抗鼠CD40抗體檢測后，41.6%的細胞表達小鼠CD40蛋白，而在B-hCD40小鼠中，小鼠CD40蛋白無表達。在純合B-hCD40小鼠中，人CD40蛋白經過抗人CD40抗體檢測后，58.1%的細胞表達人CD40蛋白，而在野生型小鼠中，人CD40蛋白無表達(圖3B)。

圖3 人CD40在mRNA水平和蛋白水平表達情況

2.4 B-hCD40小鼠各淋巴細胞亞群分布

經過改造后的B-hCD40小鼠的B細胞、T細胞、NK細胞、DC細胞、粒性白細胞、巨噬細胞和單核細胞分布情況與野生型小鼠保持一致，無明顯改變(圖4A、圖4B)。兩種小鼠CD4陽性細胞、CD8陽性細胞和Treg細胞在T細胞中分布也無明顯改變(圖4C)。以上結果共同提示，CD40人源化改造不影響小鼠各淋巴細胞亞群的分布。

圖4 B-hCD40小鼠脾臟細胞各淋巴細胞亞群分析

2.5 CD40 Ab抑制腫瘤生長情況

在首次給藥后第18天，生理鹽水對照組腫瘤平均體積為(2 661±350)mm3，CD40 Ab(3 mg/kg)給藥組平均腫瘤體積為(485±195)mm3，TGI為85.8%。相比于溶劑對照組，CD40 Ab給藥組腫瘤體積顯著減小(P<0.001)(圖5A)。以上結果提示，B-hCD40小鼠可以作為評價CD40抗體藥效的一種有效動物模型。在CD40 Ab發揮抑制腫瘤生長作用同時，實驗動物體質量相比于對照組增加不是很明顯(圖5B)，我們推測CD40 Ab作用小鼠后可能對小鼠自身產生一定毒副作用。

圖5 基于B-hCD40小鼠的CD40 Ab藥效評價

2.6 CD40 Ab抗體體內毒性評價結果

首次給藥后第2、8和12天，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠體質量與溶劑對照組相比有明顯降低(圖6A)。首次給藥后第11天，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠ALT和AST水平顯著升高(圖6B)，提示對CD40小鼠肝臟產生一定毒性作用。實驗終點小鼠各臟器HE染色結果顯示(圖6C)，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠肝臟和腎臟中可以明顯觀察到有炎性細胞聚集，C57BL/6小鼠各給藥組均沒有這種現象，表明CD40 Ab對B-hCD40小鼠肝臟和腎臟產生了毒性作用。以上結果提示，B-hCD40小鼠可以作為評價CD40抗體藥物毒性的一種工具小鼠。

圖6 CD40 Ab抗體的毒性作用

3 討論

B-hCD40小鼠模型可以為在小鼠中驗證人單克隆抗體提供一種有效的方法。我們的研究首先構建了靶向B-hCD40小鼠模型，將小鼠CD40基因的胞外區替換為人源組分。B-hCD40小鼠能表達人源胞外區和鼠源跨膜區及鼠源胞內區的嵌合蛋白，保留了小鼠胞內蛋白序列，可以最小化影響小鼠胞內信號的傳遞。單克隆抗體CD40 Ab靶向的嵌合蛋白的胞外區剛好為人源化的蛋白序列。由于嵌合mRNA來自內源性小鼠啟動子的轉錄，并且改造后的嵌合人/鼠蛋白表達包含小鼠跨膜和胞內結構域，我們推測其對下游信號傳遞的生理過程的影響極小。RT-PCR和流式細胞術鑒定出人CD40在野生型小鼠中沒有表達，但在純合子小鼠中觀察到表達，與野生型小鼠相比，純合子動物高水平的表達人mRNA和蛋白。小鼠CD40在野生型小鼠中表現出高水平的表達，但在純合子小鼠中沒有表達，這也清楚地表明B-hCD40小鼠模型是成功的。

在單克隆抗體的腫瘤免疫治療中，T細胞活化需要雙重信號的刺激，首先是T細胞抗原受體(TCR)特異性識別MHCI/抗原復合物產生的第一信號，同時需要共刺激分子(如4-1BB-4-1BBL、CD40-CD40 L、CD27-CD27 L和OX40-OX40 L等)活化產生第二信號[12]。CD40作為一類共刺激分子，和受體CD40 L結合后激活APC細胞誘導一系列下游信號通路，介導廣泛的免疫及炎癥反應。CD40激動劑單克隆抗體在激活APC促進T細胞介導的抗腫瘤免疫同時，也可以激活非T細胞介導的髓系來源細胞的細胞毒作用[13]。我們成功構建B-hCD40小鼠模型后，對HB 14抗體在這種模型上的藥效和毒性作用進行了評價。結果顯示CD40 Ab能夠顯著抑制MC38結腸癌腫瘤的生長，并且在發揮藥效的同時可能會對小鼠肝臟和腎臟產生一定毒副作用。

目前，用于腫瘤藥物開發及應用研究的幾種小鼠模型主要包括自發或誘導的小鼠腫瘤模型、基因工程小鼠模型、人源腫瘤細胞系異種移植和人源腫瘤異體移植模型等[14]。通過基因改造獲得的免疫檢查點人源化小鼠模型由于小鼠免疫系統健全，在評價藥效作用同時也可以用于藥物毒性評價，并且由于基因改造獲得的小鼠模型相對穩定，小鼠批間差異較小，實驗重復性較高，對于藥物臨床前作用評價也很有利。我們的研究表明，B-hCD40小鼠可以作為評價CD40激動劑單克隆抗體藥物臨床前藥效和毒性作用的一種有效動物模型。同時，免疫檢查點人源化小鼠模型也具有制備周期長、制備過程復雜等特點，這在一定程度上可能會限制其在疾病基礎研究和藥物開發中的應用。