miR-625在胃癌患者血清中的表達及與胃蛋白酶原水平的相關性*

王 偉，鄭水平，羅 琴

（荊門市中醫醫院 1.脾胃一科；2.脾肺病科，荊門 448000）

胃癌是一種起源于胃黏膜細胞的常見惡性腫瘤，發病率男性高于女性，且多發于中老年人群。由于人們不良生活習慣和生活環境影響，近年來胃癌發病率呈逐年升高趨勢[1]。胃癌早期癥狀與其他胃部疾病相似，不具有典型特征，導致大部分胃癌在早期難以被診斷而進展至中晚期，中晚期胃癌患者生存率極低[2]。探尋胃癌生物標志物、提高早期診出率是改善患者預后重要手段。研究表明，胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG）對慢性胃炎患者胃黏膜損傷具有一定診斷價值[3]。血清胃蛋白酶原Ⅰ（PepsinogenⅠ，PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ）及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ（Pepsinogen rate，PGR）可用于胃癌大規模篩查，提高胃癌早期診斷率[4]。Zhang 等[5]研究發現，人腦膠質瘤組織和細胞中miR-625表達水平低于正常腦組織和人星形膠質細胞，其可能通過影響癌細胞周期和凋亡發揮抑癌作用，或許可作為膠質瘤診斷靶點和預后標志物。胃癌組織中miR-625 表達水平及其與PG 相關性如何目前少見相關報道，本研究旨在分析miR-625 與PGⅠ、PGⅡ、PGR 水平相關性及其在胃癌中的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016 年2 月至2019 年2 月荊門市中醫醫院收治的246例胃部疾病患者作為研究對象。經胃鏡檢查和病理切片檢查，根據中華醫學會消化病學分會《中國慢性胃炎共識意見》[6]和國際抗癌聯盟TNM分期第7版[7]，將入組患者分為胃癌組84例，慢性萎縮性胃炎組73例，慢性非萎縮性胃炎組89例。胃癌組中男49 例，女35 例，年齡35～79 歲，平均（63.24±18.37）歲；慢性萎縮性胃炎組中男40 例，女33 例，年齡32～75 歲，平均（61.59±16.13）歲；慢性非萎縮性胃炎組中男52例，女37例，年齡34～76歲，平均（62.05±16.68）歲。納入標準：①所有入組患者均行胃鏡檢查和病理切片檢查，確診為相應疾病。②臨床及病理資料完整。③近1個月內未服用抗生素類、質子泵抑制劑類藥物。排除標準：①合并患有其它部位惡性腫瘤者。②合并患有全身嚴重感染性疾病者。③心、腎、肝臟功能嚴重不足者。④有胃部手術史。另選取同期本院體檢的89 例健康者作為健康對照組，其中男54例，女35例，年齡31～74歲，平均（61.84±17.95）歲。各組年齡、性別比例比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會批準同意，患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號：7900，美國ABI公司）、qRT-PCR試劑盒（貨號：RR820A，大連寶生物公司）、總RNA提取試劑盒（貨號：KL073，上海康朗生物科技有限公司）、反轉錄試劑盒（貨號：205311，德國Qiagen公司）、PGⅠ酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號：JK-(a)-1667，上海晶抗生物工程有限公司）、PGⅡELISA試劑盒（貨號：JK-00116，上海晶抗生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

所有入組患者和健康者分別于入組時和體檢時清晨（7:00～9:00）空腹狀態下采集外周靜脈血5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心20min后，取上清液分裝于無菌EP管中，于-80 ℃條件下保存。

1.3.2 血清miR-625表達水平檢測

采用qRT-PCR 法檢測miR-625 表達水平。Trizol 法提取總RNA 后，反轉錄獲得cDNA，用于qRT-PCR 實驗。20 μL 反應體系：10μL Mix Taq II，0.8μL 上游引物，0.8μL 下游引物，2μL cDNA，0.4μL ROX，6.0μL ddH2O。具體反應步驟：95 ℃、35 s，1 循環；95 ℃、5 s；64 ℃、35 s，40 循環。每個樣本重復3次，用2-ΔΔCT法計算miR-625表達水平，所用引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 血清PGⅠ、PGⅡ、PGR水平檢測

采用ELISA 法檢測血清PGⅠ、PGⅡ表達水平并計算PGR 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較用t檢驗；計數資料用百分率（%）表示，組間比較用χ2檢驗。采用Pearson 法進行相關性分析，采用Logistic 回歸模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平比較

胃癌組、慢性萎縮性胃炎組、慢性非萎縮性胃炎組PGⅡ水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。胃癌組、慢性萎縮性胃炎組、慢性非萎縮性胃炎組血清miR-625、PGⅠ及PGR水平均顯著低于健康對照組（均P＜0.05）；胃癌組血清miR-625、PGⅠ及PGR 水平均顯著低于慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組（均P＜0.05）；慢性萎縮性胃炎組血清miR-625、PGⅠ及PGR水平均顯著低于慢性非萎縮性胃炎組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平比較

2.2 血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平與胃癌患者臨床病理特征關系

血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR 水平在不同年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度胃癌患者之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。另外，血清PGⅡ水平在分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移情況之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與腫瘤分化程度為高中分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移胃癌患者相比，腫瘤分化程度為低分化、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的胃癌患者血清miR-625、PGⅠ、PGR水平較低（P＜0.05），見表3。

表3 血清miR-625、PGⅠ、PGⅡ及PGR水平與胃癌患者臨床病理特征關系

2.3 胃癌患者血清miR-625 與PGⅠ、PGR 水平相關性

胃癌患者血清中miR-625 與PGⅠ水平呈正相關關系（r=0.422，P=0.000），與PGR 呈正相關（r=0.501，P=0.000），見圖1、圖2。

圖1 胃癌患者血清中miR-625與PGⅠ水平相關性

圖2 胃癌患者血清中miR-625與PGR水平相關性

2.4 胃癌發生危險因素分析

以胃癌是否發生為因變量，TNM 分期、淋巴結轉移、PGⅠ水平、PGR 水平及miR-625 水平為自變量進行logistic回歸模型分析，結果發現有淋巴結轉移、PGⅠ低水平、PGR 低水平及miR-625 低水平是影響胃癌發生的獨立危險因素（均P＜0.05），見表4。

表4 胃癌發生危險因素分析

2.5 血清miR-625、PGⅠ及PGR聯合檢測對胃癌診斷效能

血清miR-625 預測胃癌敏感度為71.60%，特異度為85.70%，曲線下面積為0.849（圖3）。PGⅠ預測胃癌敏感度為66.60%，特異度為84.50%，曲線下面積為0.784（圖4）。PGR預測胃癌敏感度為79.70%，特異度為67.90%，曲線下面積為0.769（圖5）。三者聯合檢測預測胃癌敏感度為97.60%，特異度為82.40%，曲線下面積為0.947（圖6）。

圖3 血清miR-625對胃癌診斷效能

圖4 血清PGⅠ對胃癌診斷效能

圖5 血清PGR對胃癌診斷效能

圖6 血清miR-625、PGⅠ和PGR聯合檢測對胃癌診斷效能

3 討論

PG 是胃蛋白酶前體，由泌酸腺主細胞合成，可反映胃黏膜形態和功能。PGⅠ水平升高與胃酸分泌增多有關，水平降低可能預示胃黏膜腺體萎縮等發生[3]。Su 等[8]研究發現，低PGR 值是萎縮性胃炎發生危險因素。本研究結果顯示，血清PGⅠ、PGR在胃癌組、慢性萎縮性胃炎組、慢性非萎縮性胃炎組水平均明顯低于健康對照組，提示血清PGⅠ及PGR水平可能與胃部疾病發生有關。本研究中，PGⅡ在各組中水平比較差異無統計學意義，可能原因是PGⅡ成熟腺細胞分泌，來源廣泛不具特異性，而PGⅠ主要來源于胃主細胞和粘液細胞，能反映胃黏膜病變水平。

有研究表明，PG對檢測胃癌癌前風險病變有一定價值，PGⅠ可能作為早期胃癌診斷標志物[9]。研究報道，血清PGⅠ及PGR水平在對照組、萎縮性胃炎組、胃癌組中逐漸降低[10]。本研究結果顯示，與慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組相比，胃癌組患者血清中PGⅠ、PGR水平均明顯降低，與黃喜順等[10]研究結果相似，提示低水平的血清PGⅠ、PGR水平可能與胃癌發生有關。有研究證實，晚期胃癌組與早期胃癌組患者PGⅠ水平比較，差異顯著[11]。徐娟等[12]研究發現，不同TNM分期胃癌患者PGR差異有統計學意義，PGR對胃癌患者病情和預后評估有一定幫助。本研究結果發現，與腫瘤分化程度為高中分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移胃癌患者相比，腫瘤分化程度為低分化、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的胃癌患者血清PGⅠ、PGR 水平較低，與前人[11-12]研究結果相似，提示胃癌病情進展可能影響血清PGⅠ、PGR水平。

Zhou 等[13]研究報道，肝細胞癌中miR-625 低表達與腫瘤高TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及總生存期短有關。本研究結果顯示，健康對照組、慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組中miR-625 表達水平依次顯著降低，提示miR-625 的表達異常可能與胃癌及不同類型胃炎的發生相關。費玲等[14]研究發現，非小細胞肺癌患者血漿miR-625 表達水平遠低于肺良性疾病者，其表達變化與腫瘤的臨床分期有關，且可作為臨床診斷非小細胞肺癌的分子標記物。有研究證實，miR-625 在胃癌組織中表達水平下調，且低表達miR-625 患者的淋巴結轉移、遠處轉移及總體生存率明顯低于高表達miR-625 患者[15]。本研究結果顯示，腫瘤分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的胃癌患者血清miR-625水平較低明顯低于腫瘤分化程度為高中分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者，提示miR-625 低表達可能與胃癌發展有關。

幽門螺旋桿菌是影響胃癌發病的主要因素之一，有研究發現，血清PGR 在幽門螺旋桿菌感染患者治療后水平升高，可作為幽門螺旋桿菌根除治療成功的評價標準[16]。梁藝鐘等[17]研究發現，隨著幽門螺桿菌根除率升高，慢性胃炎患者血清PGⅠ水平升高，提示PGⅠ和PGR 水平與幽門螺桿菌感染有關。有研究表明，IL-10基因多態性與幽門螺桿菌陽性患者消化性潰瘍風險增加有關。Dong 等[18]研究報道，哮喘患兒血漿miR-625表達水平明顯下降，可能通過靶向炎癥細胞因子IL-10，導致哮喘發作，提示miR-625 可能通過IL-10 影響幽門螺桿菌感染水平。本研究結果發現，胃癌患者血清中miR-625 與PGⅠ、PGR表達水平呈正相關，提示miR-625與PGⅠ、PGR 之間可能存在相互作用，通過影響患者幽門螺桿菌感染，參與胃癌進展。但具體機制尚需進一步深入研究證實。

進一步研究發現，有淋巴結轉移、PGⅠ低水平、PGR低水平及miR-625低水平是影響胃癌發生獨立危險因素，進一步提示血清miR-625、PGⅠ、PGR低水平與胃癌發生有關，可能作為生物標志物，對預測胃癌發生有一定意義。本研究還發現，血清miR-625、PGⅠ、PGR 水平均對胃癌有一定診斷價值，但靈敏度或特異度較低，三者聯合檢測時的敏感度均比三者單獨檢測時高，提示三者聯合檢測對胃癌診斷效能較高，可能作為臨床胃癌診斷指標。

綜上所述，與健康對照組、慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組相比，胃癌組患者血清中miR-625 表達水平明顯降低，與PGⅠ、PGR 水平呈正相關，且與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關。miR-625、PGⅠ、PGR低水平是胃癌發生獨立危險因素。血清miR-625、PGⅠ、PGR 聯合檢測對胃癌診斷具有一定價值。但由于本研究樣本量較少，研究方法較為單一，具體機制尚需大量實驗進一步深入研究。