金黃色葡萄球菌β溶血素研究進展

諸葛石養 蘇愛榮 黃彥 李秀桂

【關鍵詞】 金黃色葡萄球菌;溶血素;分子特征

中圖分類號：R378.1+ 文獻標志碼： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.014

溶血素作為金黃色葡萄球菌分泌的胞外毒素之一，是造成醫院和社區獲得性感染重要的致病因子[1]。根據抗原性不同可分為α、β、γ和δ溶血素四種類型，β溶血素能引起人類皮膚黏膜化膿性感染、慢性骨髓炎[2]、感染性肺炎，以及動物眼角膜炎[3]和乳腺炎[4]等。β溶血素的相關研究目前國內報道相對較少，為了給同行學者研究提供理論參考，本文對金黃色葡萄球菌β溶血素的分子結構、生化特性、致病作用及免疫預防等方面進行綜述。

1 分子結構

1935年GLENNY和 STEVENS首次發現一種不同于α溶血素的酯酶類毒素，1989年PROJAN正式公開了其完整的基因序列，并命名為β溶血素。β溶血素由330個氨基酸和1個終止子組成的單鏈多肽分子，其N末端為Glu Ser Lys Lys Asp Asp Thr Asp Leu Lys，起始1～34位氨基酸為一段信號肽，全長約993 bp，相對分子量約為37 kDA。β溶血素為四層三明治結構，富含無規則卷曲，中心含有兩個β折疊片和四個α螺旋[5]，其中β折疊結構含量最少為18.8%，α螺旋結構含量是21.8%。β溶血素其中一個β折疊片上的兩條β折疊股形成的獨特結構與DNaseⅠ超家族成員有高度同源性，因此本質上隸屬DNaseⅠ超家族。

2 生化特性β溶血素在低溫條件下較為穩定，4℃可以保存3天，凍干后4℃能保存長達4個月。對胰蛋白酶較為敏感，對福爾馬林有一定的耐受作用，pH為5.5時β溶血素的活性最高。β溶血素在細菌對數生長期早期合成速度最快，一般24小時達到峰值。聚β羥基丁酸酯和齊墩果酸對β溶血素活性均有明顯抑制作用[6]。在培養過程中加入10%～25%CO2能提高β溶血素活性[7]。β溶血素活性具有細胞和物種的特異性[8]，對綿羊、牛和山羊紅細胞最為敏感，豚鼠、馬、大白鼠、小白鼠和禽類紅細胞對β溶血素均不敏感，而對家兔、人、豬和貓紅細胞則次之。β溶血素對哺乳動物的紅細胞敏感性高低與細胞膜神經鞘磷脂的含量呈正相關，對單核細胞的敏感性均大于淋巴細胞、粒細胞和纖維母細胞[9]。

3 致病機制β溶血素除了傳統的溶血功能之外，還有其他多種生物學功能，比如白細胞毒性、促進生物膜形成、抑制初始免疫反應、引發細胞壞死或凋亡和誘發肺部感染等[10]。

3.1 溶血功能

與α、γ和δ三種成孔溶血素完全不同，β溶血素損傷細胞膜并不形成孔道[11]。它是一種依賴Mg2+的中性神經鞘磷脂酶，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性，水解卵磷脂產生帶電荷的磷脂酰基團和非極性二酰甘油，水解鞘磷脂產生磷酸膽堿和神經酰胺，這些產物能損傷紅細胞膜，引起溶酶體膜通透性增加，大量水解酶釋放至胞漿，通過剪切下游信號分子引發紅細胞裂解[12]。在Mg2+協同作用下，β溶血素在體外培養能產生獨特的“熱冷效應”，即首先進行一段時間37℃培養，紅細胞膜形態未發生任何改變，再繼續進行一段時間4℃低溫培養后，紅細胞膜表面就會形成內陷，甚至可能會出現部分或全部膜瓦解的狀態，表明β溶血素在低溫條件下溶血活性顯著提高，溶血能力也較α、γ和δ溶血素弱[13]。有研究顯示將β溶血素149或287位的組氨酸突變為天冬酰胺時，其溶血活性則完全消失[14]。

3.2 白細胞毒性

神經鞘磷脂是細胞生物膜的重要組成部分，人白細胞膜的神經鞘磷脂含量占磷脂總量的10%～15%，研究顯示β溶血素具有較強的白細胞毒性。SALGADOPABON等[15]研究表明，濃度為1 ng/mL的β溶血素在體外“冷熱”培養可以導致大約325個中性粒細胞和淋巴細胞完全溶解，顯微電鏡掃描顯示白細胞膜喪失了表面皺褶，并呈現細胞膜塌陷或整體瓦解。KRUSE等[16]發現β溶血素的一個疏水性β折疊發夾結構為溶解淋巴細胞作用的活性部位，將其第152或289位的組氨酸突變為天冬酰胺后，淋巴細胞毒性作用則完全消失。CHEN等[17]報道β溶血素作用于單核細胞后能夠迅速誘導IL1β的表達增加，導致IL6受體和脂多糖受體脫落，最終裂解單核細胞。BHAGWAT等[18]在進行金黃色葡萄球菌（β溶血素陽性株）與T細胞共同孵育時發現，T細胞的平均存活率顯著降低，β溶血素陽性株和β溶血素陰性株的T細胞平均存活率分別為33.00%和82.55%，兩者差異有統計學意義，表明β溶血素對T細胞具有明顯的毒性作用。

3.3 抑制初始免疫反應

β溶血素通過抑制局部單核巨噬細胞或其他輔佐細胞的吞噬和處理，使抗原不能以有效的方式（與MHCⅡ類分子結合）遞呈給TH細胞來達到抑制初始免疫反應的目的。JUNG等[19]報道β溶血素水解人內皮細胞膜上的鞘磷脂產生神經酰胺。神經酰胺作為第二信使分子則啟動胞內相關的信號通路，阻斷表皮生長因子受體來抑制ERK1/2的磷酸化，進而破壞下游信號通路，降低IL8轉錄水平，導致IL8分泌減少。IL8作為中性粒細胞的趨化劑，IL8的分泌減少將導致中性粒細胞向炎癥部位遷移受到抑制。HERRETA等[20]還報道β溶血素的水解產物神經酰胺能激活NOD樣受體蛋白3（NLRP3），誘導產生大量的半胱氨酸天門冬氨酸酶1（Caspase1）。Caspase1能阻斷IL1β前體和IL18前體形成具有活性效應的IL1β和IL18，從而抑制粒細胞濃集釋放炎癥因子，進而降低初始免疫反應。

3.4 促進生物定植

生物膜是由細胞外基質包裹的微生物群落，大約80%的細菌感染都與生物膜的形成有關。金黃色葡萄球菌極易黏附在皮膚黏膜、醫療導管和植入式醫療耗材表面形成牢固的生物膜，抵御宿主防御機制的攻擊[21]。β溶血素具有生物膜連接酶活性[22]，誘導形成共價核蛋白復合物，通過損傷皮膚黏膜上皮細胞和促進生物膜形成方式在其定植過程中發揮關鍵作用。

KATAYAMA等在小鼠耳部皮膚定植模型中發現，表達β溶血素的MW2菌株（φSa3缺失）比野生型MW2菌株的定植效率高出50倍以上，進一步研究顯示β溶血素在潛伏期內就對人類角質形成細胞具有顯著的細胞毒性，有利于金黃色葡萄球菌在皮膚黏膜表面定植[23]。MELNIK[24]報道攜帶完整β溶血素基因的金黃色葡萄球菌（φSa3丟失）在人鼻腔黏膜定植持續高達14天，而攜帶φSa3菌株持續定植僅有3天。PHUONG等[25]在兔子感染性心內膜炎模型中證實，表達β溶血素的MW2菌株（φSa3丟失）在H2O2氧化應激誘導下可以誘導Cid基因轉錄，增加胞外DNA含量，最終促進主動脈內皮細胞生物膜形成。HUSEBY等[26]將β溶血素與DNA共同孵育時，β溶血素并未表達明顯的核酸酶活性，而是與單鏈或雙鏈DNA形成自身共價交聯，產生不溶性的核蛋白基質，形成較為牢靠的生物膜骨架。金黃色葡萄球菌COL（hlb+）在流動池中形成的生物膜比金黃色葡萄球菌COL（hlb）更快和更厚，而在兔主動脈中形成明顯的生物膜，平均重量（220±34）mg，細菌數為log108.28±0.26，4天后生物膜幾乎完全阻塞了整條主動脈，而金黃色葡萄球菌COL（hlb）形成生物膜平均重量僅為（2.5±4.3）mg，細菌數量只有log106.14±0.22。HERRERA等[8]研究發現β溶血素通過整合素依賴活化誘導血小板聚集，抑制CD40和血管細胞黏附分子1在血管內皮細胞表面表達，以延遲宿主免疫系統的激活，血管內皮細胞表面細菌負荷會增加，從而促進生物膜形成。生物膜形成的多寡與β溶血素濃度的呈正相關。

3.5 細胞壞死或凋亡

壞死是細胞內大分子物質的降解，主要依賴溶酶體破裂后釋放的酶類[27]。β溶血素能直接損傷細胞溶酶體，引起半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B釋放，激活NLRP3炎性小體[28]，并誘導細胞壞死。凋亡是細胞程序性死亡，為DNA內源性內切酶作用下被裂解。β溶血素水解靶鞘磷脂產生神經酰胺能激活Caspase3。作為一種蛋白酶，Caspase3屬于細胞凋亡中心環節的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族中的下游效應者。Caspase3被活化后產生凋亡蛋白酶的級聯反應，細胞內的炎性蛋白酶被激活，NFκB、IL1β、1L18等炎癥因子的表達增多，進而降解細胞內的重要蛋白質，最終引起細胞不可逆凋亡[29]。

4 免疫預防金黃色葡萄球菌β溶血素是造成奶牛乳腺炎流行的重要因子，導致牛奶產量和質量的降低，給奶牛產業帶來巨大的經濟損失。基于疫苗高效、安全和經濟的特點，奶牛乳腺炎疫苗受到國內外學者的廣泛重視。目前國內外均有相關的β溶血素疫苗研究報道，但至今尚未能普及應用。魏春梅[30]利用牛源性重組β溶血素亞單位疫苗治療由金黃色葡萄球菌菌株Newbould305誘導的乳腺炎，結果顯示其能誘導小鼠機體IL6分泌增加，減少乳腺內細菌感染的數量，并能在一定程度上將感染病灶局限化。李光超[31]將純化β溶血素和pcDNA3.1HisBhlb質粒分別與福氏佐劑乳化混合制成亞單位疫苗和DNA疫苗，強化免疫小鼠10天后，實驗組IgG水平和IL2濃度均顯著高于對照組，亞單位疫苗對小鼠乳腺細胞的保護作用要明顯強于pcDNA3.1HisBhlbDNA疫苗。管玉等人[32]通過構建原核表達質粒pET32ahlb，并在大腸桿菌BL21 （DE3）中誘導表達抗β溶血素單鏈抗體，結果顯示抗β溶血素單鏈抗體可以顯著抑制重組hlb蛋白和金色葡萄球菌的溶血作用。AQIB等[33]利用駱駝亞臨床乳腺炎中回收具有β溶血素特性金黃色葡萄球菌，制備成滅活鋁沉淀疫苗和油佐劑疫苗，兩者產生的最高幾何平均滴度分別為37.92和69.92，并且增強劑量疫苗的平均幾何滴度明顯高于單劑劑量。

5 小結 β溶血素作為一種多功能蛋白在金黃色葡萄球菌致病性和免疫方面發揮著重要作用。盡管前期進行的大量研究工作取得了很大的進展，但依然有相當多的問題還有待解決，包括β溶血素的表達調控、溶血作用的調控途徑、乳腺炎疫苗的研制以及引起肺部感染的作用機制等等。進一步深入研究β溶血素一定能為金黃色葡萄球菌相關疾病的治療提供更為廣闊的思路。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-03-03 修回日期：2021-03-30）

（編輯：潘明志）